ارسا مونوامائڊس جي دريافت، خاصيت ۽ ڪارڪردگي بهتري، جيئن نوان ٻوٽن جي واڌ ويجهه کي روڪيندڙ آهن جيڪي ٻوٽن جي مائڪروٽيوبولس کي متاثر ڪن ٿا.

Nature.com تي اچڻ لاءِ مهرباني. توهان جي استعمال ڪيل برائوزر جي ورزن ۾ محدود CSS سپورٽ آهي. بهترين نتيجن لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان پنهنجي برائوزر جو نئون ورزن استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي غير فعال ڪريو). ساڳئي وقت، جاري سپورٽ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، اسان سائيٽ کي اسٽائلنگ يا جاوا اسڪرپٽ کان سواءِ ڏيکاري رهيا آهيون.
قدرتي شين جي دريافت ۽ فائديمند استعمال انساني زندگي کي بهتر بڻائڻ ۾ مدد ڪري سگهي ٿو. ٻوٽن جي واڌ کي روڪڻ وارا ڪيميڪل وڏي پيماني تي جڙي ٻوٽين کي ڪنٽرول ڪرڻ لاءِ جڙي ٻوٽين جي طور تي استعمال ڪيا ويندا آهن. مختلف قسمن جي جڙي ٻوٽين جي دوائن کي استعمال ڪرڻ جي ضرورت جي ڪري، عمل جي نئين ميڪانيزم سان مرکبات جي سڃاڻپ ڪرڻ جي ضرورت آهي. هن مطالعي ۾، اسان هڪ ناول N -alkoxypyrrole مرڪب، coumamonamide، Streptomyces werraensis MK493-CF1 مان دريافت ڪيو ۽ مڪمل سنٿيسس جي عمل کي قائم ڪيو. حياتياتي سرگرمي جي تجزيي ذريعي، اسان دريافت ڪيو ته urs-monoamic acid urs-monoamide جو هڪ مصنوعي وچولي آهي ۽ هڪ امڪانيٻوٽن جي واڌ کي روڪيندڙ. ان کان علاوه، اسان مختلف urbenonic acid derivatives تيار ڪيا آهن، جن ۾ urbenyloxy derivative (UDA) شامل آهي، جنهن ۾ HeLa سيلز جي واڌ کي منفي طور تي متاثر ڪرڻ کان سواءِ جڙي ٻوٽين جي سرگرمي وڌيڪ آهي. اسان اهو پڻ ڏٺو ته urmotonic acid derivatives ٻوٽن جي مائڪروٽيوبلز کي خراب ڪن ٿا؛ ان کان علاوه، KAND ايڪٽين فليمينٽس کي متاثر ڪري ٿو ۽ سيل جي موت کي متاثر ڪري ٿو؛ اهي گهڻ رخي اثر سڃاتل مائڪروٽيوبيل انابيٽرز کان مختلف آهن ۽ ursonic acid لاءِ عمل جو هڪ نئون طريقو تجويز ڪن ٿا، جيڪو نئين جڙي ٻوٽين جي دوائن جي ترقي ۾ هڪ اهم فائدو پيش ڪري ٿو.
فائديمند قدرتي شين ۽ انهن جي نڪتن جي دريافت ۽ عملي استعمال انساني زندگي جي معيار کي بهتر بڻائڻ جو هڪ ذريعو آهي. مائڪروجنزمن، ٻوٽن ۽ حشرات پاران پيدا ٿيندڙ ثانوي ميٽابولائٽس طب ۽ زراعت ۾ وڏي ترقي جو سبب بڻيا آهن. ڪيتريون ئي اينٽي بايوٽڪ ۽ اينٽي ليوڪيميا دوائون قدرتي شين مان تيار ڪيون ويون آهن. ان کان علاوه، مختلف قسمن جاڪيڙا مار دوائون، فنگسائيڊس ۽ جڙي ٻوٽي مار دوائون زراعت ۾ استعمال لاءِ انهن قدرتي شين مان ڪڍيون وينديون آهن. خاص طور تي، جديد زراعت ۾ فصلن جي پيداوار وڌائڻ لاءِ جڙي ٻوٽين جي ڪنٽرول اهم اوزار آهن، ۽ مختلف قسم جا مرکبات اڳ ۾ ئي تجارتي طور تي استعمال ڪيا ويندا آهن. ٻوٽن ۾ ڪيترائي سيلولر عمل، جهڙوڪ فوٽو سنٿيسس، امينو ايسڊ ميٽابولزم، سيل وال سنٿيسس، مائيٽوسس جو ضابطو، فائٽو هارمون سگنلنگ، يا پروٽين سنٿيسس، جڙي ٻوٽي مار دوائن جا عام هدف سمجهيا وڃن ٿا. مرڪب جيڪي مائڪروٽيوبول جي ڪم کي روڪيندا آهن اهي جڙي ٻوٽي مار دوائن جو هڪ عام طبقو آهي جيڪو مائيٽوٽڪ ريگيوليشن کي متاثر ڪندي ٻوٽن جي واڌ کي متاثر ڪري ٿو.
مائڪروٽيوبولس سائيٽوسڪيلٽن جا جزا آهن ۽ يوڪريوٽڪ سيلز ۾ وڏي پيماني تي محفوظ آهن. ٽيوبلين هيٽروڊيمر ۾ α-ٽيوبلين ۽ β-ٽيوبلين شامل آهن جيڪي لڪير مائڪروٽيوبولس پروٽوفيلامينٽ ٺاهيندا آهن، جن ۾ 13 پروٽوفيلامينٽ هڪ سلنڈرڪ ڍانچي ٺاهيندا آهن. مائڪروٽيوبولس ٻوٽن جي سيلز ۾ ڪيترائي ڪردار ادا ڪن ٿا، جنهن ۾ سيل جي شڪل، سيل ڊويزن، ۽ اندروني ٽرانسپورٽ جو تعين شامل آهي 3,4. ٻوٽن جي سيلز ۾ انٽرفيز پلازما جھلي جي هيٺان مائڪروٽيوبولس هوندا آهن، ۽ اهي نام نهاد ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس سيلولوز سنٿيس ڪمپليڪس 4,5 جي ضابطي ذريعي سيلولوز مائڪروفيبرلز جي تنظيم کي ڪنٽرول ڪرڻ لاءِ سوچيو ويندو آهي. روٽ ايپيڊرمل سيلز جا ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس، جيڪي روٽ جي چوٽي جي تيزيءَ سان ڊگھائي جي زون ۾ موجود آهن، پاسي واري طرف واقع آهن، ۽ سيلولوز مائڪرو فائبر انهن مائڪروٽيوبولس جي پيروي ڪندا آهن ۽ سيل جي توسيع جي هدايت کي محدود ڪندا آهن، ان ڪري اينيسوٽروپڪ سيل جي ڊگھائي کي فروغ ڏيندا آهن. تنهن ڪري، مائڪروٽيوبولس جو ڪم ٻوٽي جي مورفولوجي سان ويجهي سان لاڳاپيل آهي. جينز ۾ امينو ايسڊ متبادل جيڪي ٽيوبلين کي انڪوڊ ڪن ٿا، ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبول صفن جي اسڪوچ ۽ عربيڊوپسس 6,7 ۾ کاٻي يا ساڄي پاسي واري واڌ جو سبب بڻجن ٿا. ساڳئي طرح، مائڪروٽيوبول سان لاڳاپيل پروٽين ۾ ميوٽيشن جيڪي مائڪروٽيوبول جي حرڪيات کي منظم ڪن ٿا، اهي پڻ جڙ جي واڌ کي بگاڙي سگهن ٿا8,9,10,11,12,13. ان کان علاوه، مائڪروٽيوبول کي خراب ڪندڙ جڙي ٻوٽي جي دوائن جهڙوڪ ڊسپوئرامائيڊ، جنهن کي پريٽيلا ڪلور پڻ سڏيو ويندو آهي، سان علاج پڻ کاٻي پاسي واري ترچھي جڙ جي واڌ جو سبب بڻجندو آهي14. اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته مائڪروٽيوبول جي ڪم جو صحيح ضابطو ٻوٽن جي واڌ جي هدايت کي طئي ڪرڻ لاءِ اهم آهي.
مختلف قسمن جا مائڪروٽيوبول انابيٽر دريافت ڪيا ويا آهن، ۽ انهن دوائن سائٽو اسڪيليٽل ريسرچ، انهي سان گڏ زراعت ۽ دوائن ۾ اهم ڪردار ادا ڪيو آهي. خاص طور تي، اوريزالن، ڊائنائٽروانيلين مرکبات، ڊسوپيرامائيڊ، بينزامائيڊ سان لاڳاپيل مرکبات، ۽ انهن جا اينالاگ مائڪروٽيوبول جي ڪم کي روڪي سگهن ٿا ۽ ان ڪري ٻوٽن جي واڌ کي روڪي سگهن ٿا. تنهن ڪري، انهن کي وڏي پيماني تي جڙي ٻوٽي جي طور تي استعمال ڪيو ويندو آهي. جڏهن ته، مائڪروٽيوبول ٻوٽن ۽ جانورن جي سيلن جو هڪ اهم جزو آهن، گهڻا مائڪروٽيوبول انابيٽر ٻنهي سيل قسمن لاءِ سائيٽوٽوڪسڪ آهن. تنهن ڪري، جڙي ٻوٽي جي طور تي انهن جي تسليم ٿيل افاديت جي باوجود، محدود تعداد ۾ اينٽي مائڪروٽيوبول ايجنٽ عملي مقصدن لاءِ استعمال ڪيا ويندا آهن.
اسٽريپٽومائسز اسٽريپٽومائسز خاندان جو هڪ جينس آهي، جنهن ۾ ايروبڪ، گرام-مثبت، فليمينٽس بيڪٽيريا شامل آهن ۽ وڏي پيماني تي ثانوي ميٽابولائٽس جي وسيع رينج پيدا ڪرڻ جي صلاحيت لاءِ مشهور آهي. تنهن ڪري، ان کي نئين حياتياتي طور تي فعال قدرتي شين جي سڀ کان اهم ذريعن مان هڪ سمجهيو ويندو آهي. موجوده مطالعي ۾، اسان ڪومامونامائيڊ نالي هڪ نئون مرڪب دريافت ڪيو، جيڪو اسٽريپٽومائسز ويرائنسس MK493-CF1 ۽ S. ويرائنسس ISP 5486 کان الڳ ڪيو ويو هو. اسپيڪٽرل تجزيو ۽ مڪمل اسپيڪٽرل تجزيو استعمال ڪندي، ڪومامونامائيڊ جي جوڙجڪ جي خاصيت ڪئي وئي ۽ ان جي منفرد N-alkoxypyrrole اسڪيليٽن جو تعين ڪيو ويو. سنٿيسس. ارسمونومائيڊ ۽ ان جي ڊيريويٽيوز جو هڪ مصنوعي وچولي، مشهور ماڊل پلانٽ Arabidopsis thaliana جي واڌ ۽ انڪروميشن کي روڪڻ لاءِ مليو. هڪ structure-activity relationship study ۾، اسان ڏٺو ته C9 سان هڪ مرڪب جيڪو ارسونڪ ايسڊ ۾ تبديل ڪيو ويو آهي، جنهن کي ارسونڪ ايسڊ (KAND) جو نانائلوڪسي ڊيريويٽيو سڏيو ويندو آهي، واڌ ۽ انڪروميشن تي روڪڻ واري اثر کي خاص طور تي وڌائي ٿو. خاص طور تي، نئين دريافت ٿيل ٻوٽي جي واڌ کي روڪڻ وارو تمباکو ۽ جگر جي واڌ کي به متاثر ڪيو ۽ بيڪٽيريا يا HeLa سيلز لاءِ سائيٽوٽڪسڪ نه هو. ان کان علاوه، ڪجهه urmotonic ايسڊ ڊيريويٽوز هڪ بگڙيل روٽ فينوٽائپ پيدا ڪن ٿا، جنهن جو مطلب آهي ته اهي ڊيريويٽوز سڌي طرح يا اڻ سڌي طرح مائڪروٽيوبلز کي متاثر ڪن ٿا. هن خيال سان مطابقت رکندڙ، مائڪروٽيوبلز جي اسان جي مشاهدي ۾ يا ته امونوهسٽو ڪيميڪل طور تي يا فلوروسينٽ پروٽين سان ليبل ٿيل آهن اهو ظاهر ٿئي ٿو ته KAND علاج مائڪروٽيوبلز کي ڊيپوليمرائيز ڪري ٿو. ان کان علاوه، ڪوماموٽوڪنڪ ايسڊ ڊيريويٽوز سان علاج ايڪٽين مائڪروفيلامينٽس کي خراب ڪري ٿو. اهڙي طرح، اسان هڪ نئون ٻوٽي جي واڌ کي روڪڻ وارو دريافت ڪيو آهي جنهن جي عمل جي منفرد ميڪانيزم ۾ سائيٽوسڪيلٽن جي تباهي شامل آهي.
ٽوڪيو جي شيناگاوا-ڪو ۾ مٽيءَ مان MK493-CF1 جي نسل کي الڳ ڪيو ويو. نسل MK493-CF1 سٺي شاخن وارو اسٽرومل مائيسيليم ٺاهيو. 16S رائبوسومل آر اين اي جين (1422 bp) جو جزوي تسلسل طئي ڪيو ويو. هي نسل S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486، 1421/1422 bp، T: عام نسل، 99.93٪) سان تمام گهڻو ملندڙ جلندڙ آهي. هن نتيجي جي بنياد تي، اهو طئي ڪيو ويو ته هي نسل S. werraensis جي قسم جي نسل سان ويجهي سان لاڳاپيل هو. تنهن ڪري، اسان عارضي طور تي هن نسل جو نالو S. werraensis MK493-CF1 رکيو. S. werraensis ISP 5486T پڻ ساڳيا بايو ايڪٽو مرڪب پيدا ڪري ٿو. جيئن ته هن مائڪروجنزم مان قدرتي شين کي حاصل ڪرڻ ۾ ٿوري ابتدائي تحقيق هئي، وڌيڪ ڪيميائي تحقيق ڪئي وئي. ايس. ويرائنسس MK493-CF1 کي جَوَ جي وچولي تي 30°C تي سالڊ اسٽيٽ خمير ذريعي 14 ڏينهن تائين پوکڻ کان پوءِ، وچولي کي 50% EtOH سان ڪڍيو ويو. 60 ملي ليٽر نموني کي خشڪ ڪيو ويو ته جيئن 59.5 ملي گرام خام عرق حاصل ڪري سگهجي. خام عرق کي N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1، جنهن جو نالو ڪومامونامائيڊ، 36.0 ملي گرام آهي) ڏيڻ لاءِ ريورس فيز HPLC جي تابع ڪيو ويو. 1 جي ڪل مقدار خام عرق جو تقريباً 60% آهي. تنهن ڪري، اسان ڪوماموتوامائيڊ 1 جي خاصيتن جو تفصيل سان مطالعو ڪرڻ جو فيصلو ڪيو.
ڪومامونامائيڊ 1 هڪ اڇو بي شڪل پائوڊر آهي ۽ هاءِ ريزوليوشن ماس اسپيڪٽروميٽري (HRESIMS) C6H8N2O2 جي تصديق ڪري ٿو (شڪل 1). هن مرڪب جو C2-متبادل پائرول ٽڪرو δH 6.94 (1H، t، J = 2.8، 4.8 Hz، H-4)، δH 6.78 (1H، d، J = 2.5، δH 1H NMR اسپيڪٽرم ۾: 4.5 Hz، H-5) ۽ δH 6.78 (1H، d، J = 2.5 Hz، H-6) سان منسوب آهي، ۽ 13C NMR اسپيڪٽرم چار sp2 ڪاربن ايٽم جي موجودگي ڏيکاري ٿو. C2 پوزيشن تي هڪ امائيڊ گروپ جي موجودگي جو جائزو HMBC لاڳاپي ذريعي C-3 پروٽان کان امائيڊ ڪاربونيل ڪاربن تائين δC 161.1 تي ڪيو ويو. ان کان علاوه، δH 4.10 (3H، S) ۽ δC 68.3 تي 1 H ۽ 13 C NMR جي چوٽي ماليڪيول ۾ N-ميٿوڪسي گروپن جي موجودگي کي ظاهر ڪري ٿي. جيتوڻيڪ ميٿوڪسي گروپ جي صحيح پوزيشن اڃا تائين اسپيڪٽروسکوپيڪ تجزيو جهڙوڪ اينهانسڊ ڊفرنس اسپيڪٽروسکوپي ۽ نيوڪليئر اوور هائوسر مخفف (NOEDF) استعمال ڪندي طئي نه ڪئي وئي هئي، N-ميٿوڪسي-1H-پائرول-2-ڪاربوڪسامائيڊ پهريون اميدوار مرڪب بڻجي ويو.
1 جي صحيح بناوت کي طئي ڪرڻ لاءِ، هڪ مڪمل سنٿيسس ڪيو ويو (شڪل 2a). تجارتي طور تي دستياب 2-امينوپائريڊائن 2 جو m-CPBA سان علاج ڪرڻ جي نتيجي ۾ مقداري پيداوار ۾ لاڳاپيل N-آڪسائيڊ 3 حاصل ٿيو. 2 جي 2-امينوپائريڊيشن کان پوءِ، ابرامووچ پاران بيان ڪيل سائيڪلوڪنڊينسيشن رد عمل 90 ° C تي بينزين ۾ ڪيو ويو ته جيئن گهربل 1-هائيڊروڪسي-1H-پائرول-2-ڪاربونائٽريل 5 گرام ۾ حاصل ڪري سگهجي. رفتار 60٪ (ٻه مرحلا). 15,16. 4 جي ميٿيليشن ۽ هائيڊروليسس پوءِ 1-ميٿوڪسي-1H-پائرول-2-ڪاربو آڪسيلڪ ايسڊ (جنهن کي "ڪيوموٽوونڪ ايسڊ"، 6 سڏيو ويندو آهي) سٺي پيداوار ۾ ڏنو (70٪، ٻه مرحلا). آخرڪار، آبي امونيا استعمال ڪندي ايسڊ ڪلورائڊ انٽرميڊيئيٽ 6 ذريعي امائيڊيشن ڪوماموتو امائيڊ 1 کي 98٪ پيداوار ۾ ڏنو. سنٿيسائز ٿيل 1 جا سڀئي اسپيڪٽرل ڊيٽا الڳ ٿيل 1 سان ملندڙ جلندڙ هئا، تنهنڪري 1 جي جوڙجڪ طئي ڪئي وئي؛
اربينامائيڊ ۽ اربينڪ ايسڊ جي حياتياتي سرگرمي جو عام سنٿيسس ۽ تجزيو. (الف) ڪوماموتو امائيڊ جي ڪل سنٿيسس. (ب) ست ڏينهن پراڻا جهنگلي قسم جا عربيڊوپسس ڪولمبيا (ڪول) ٻج موراشيگ ۽ اسڪوگ (ايم ايس) پليٽن تي پوکيا ويا هئا جن ۾ ڪومامونامائيڊ 6 يا ڪومامونامائيڊ 1 شامل هئا. اسڪيل بار = 1 سينٽي ميٽر.
پهرين، اسان ٻوٽن جي واڌ ويجهه کي تبديل ڪرڻ جي صلاحيت لاءِ urbenamide ۽ ان جي وچولين جي حياتياتي سرگرمين جو جائزو ورتو. اسان MS agar وچولي ۾ ursmonamide 1 يا ursmonic acid 6 جي مختلف ڪنسنٽريشن شامل ڪئي ۽ هن وچولي تي Arabidopsis thaliana ٻج کي ڪلچر ڪيو. انهن تجزين مان ظاهر ٿيو ته 6 جي اعليٰ ڪنسنٽريشن (500 μM) جڙ جي واڌ کي روڪي ٿي (شڪل 2b). اڳيون، اسان 6 جي N1 پوزيشن کي متبادل بڻائي مختلف ڊيريويٽوز پيدا ڪيا ۽ انهن تي structure-activity relationship studies ڪيا (اينالاگ سنٿيسس عمل کي سپورٽنگ انفارميشن (SI) ۾ بيان ڪيو ويو آهي). Arabidopsis ٻج هڪ وچولي تي پوکيا ويا جنهن ۾ 50 μM ursonic acid derivatives هئا، ۽ جڙ جي ڊيگهه ماپي وئي. جيئن تصوير تي ڏيکاريل آهي. جيئن شڪل 3a، b، ۽ S1 ۾ ڏيکاريل آهي، ڪومامو ايسڊز ۾ N1 پوزيشن تي لڪير واري الڪوڪسي زنجيرن (9، 10، 11، 12، ۽ 13) يا وڏيون الڪوڪسي زنجيرون (15، 16، ۽ 17) جي مختلف ڊيگهه هوندي آهي. نڪتل جڙ جي واڌ جي اهم روڪٿام ڏيکاري. ان کان علاوه، اسان ڏٺو ته 200 μM 10، 11، يا 17 جي درخواست انڪروجن کي روڪيو (شڪلون 3c ۽ S2).
ڪوماموتو امائيڊ ۽ لاڳاپيل مرڪبن جي بناوت-سرگرمي جي تعلق جو مطالعو. (الف) اينالاگس جي بناوت ۽ سنٿيسس اسڪيم. (ب) 50 μM ڪومامونامائيڊ ڊيريويٽوز سان يا ان کان سواءِ ايم ايس ميڊيم تي پوکيل 7 ڏينهن جي ٻج جي جڙ جي ڊيگهه جو مقدار. نجمي شيم علاج سان اهم فرق ظاهر ڪن ٿا (ٽي ٽيسٽ، پي< 0.05). n>18. ڊيٽا کي سراسري ± SD طور ڏيکاريو ويو آهي. nt جو مطلب آهي "آزمائش نه ڪئي وئي" ڇاڪاڻ ته 50 سيڪڙو کان وڌيڪ ٻج نه اُڀريا. (c) علاج ٿيل ٻج جي اُڀرڻ جي شرح جو مقدار جيڪو 200 μM ڪومامونامائيڊ ۽ لاڳاپيل مرڪبن سان يا ان کان سواءِ MS ميڊيم ۾ 7 ڏينهن تائين انڪيوبيٽ ڪيو ويو آهي. ستارا شيم ٽريٽمينٽ (چي-اسڪوائر ٽيسٽ) سان اهم فرق ظاهر ڪن ٿا. n=96.
دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، C9 کان وڌيڪ ڊگهيون الڪائل سائڊ چينز جي اضافي سان روڪڻ واري سرگرمي گهٽجي وئي، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته ڪوماموٽوڪ ايسڊ سان لاڳاپيل مرکبات کي پنهنجي حياتياتي سرگرمي کي ظاهر ڪرڻ لاءِ هڪ خاص سائيز جي سائڊ چينز جي ضرورت هوندي آهي.
ڇاڪاڻ ته ساخت-سرگرمي جي تعلق جي تجزيي مان ظاهر ٿيو ته C9 کي ursonic acid ۾ تبديل ڪيو ويو هو ۽ ursonic acid جو nonyloxy derivative (جنهن کي بعد ۾ KAND 11 سڏيو ويندو) سڀ کان وڌيڪ اثرائتو ٻوٽن جي واڌ کي روڪڻ وارو هو، اسان KAND 11 جي وڌيڪ تفصيلي خاصيت ڪئي. 50 μM KAND 11 سان Arabidopsis جو علاج تقريبن مڪمل طور تي ڄمڻ کي روڪيو، جڏهن ته KAND 11 جي گهٽ ڪنسنٽريشن (40، 30، 20، يا 10 μM) جڙ جي واڌ کي دوز تي منحصر انداز ۾ روڪيو (شڪل 4a، b). اهو جانچڻ لاءِ ته ڇا KAND 11 جڙ جي ميرسٽم جي عملداريءَ کي متاثر ڪري ٿو، اسان پروپيڊيم آئوڊائيڊ (PI) سان داغدار جڙ جي ميرسٽم جي جانچ ڪئي ۽ ميرسٽم جي علائقي جي سائيز کي ماپيو. 25 μM KAND-11 تي مشتمل ميڊيم تي پوکيل ٻج جي ميرسٽم جو سائز 151.1 ± 32.5 μm هو، جڏهن ته DMSO تي مشتمل ڪنٽرول ميڊيم تي پوکيل ٻج جي ميرسٽم جو سائز 264.7 ± 30.8 μm هو (شڪل 4c، d)، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته KAND-11 سيلولر سرگرمي کي بحال ڪري ٿو. پکيڙ. روٽ ميرسٽم. ان سان مطابقت رکندڙ، KAND 11 علاج روٽ ميرسٽم ۾ سيل ڊويزن مارڪر CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS سگنل جي مقدار کي گهٽائي ڇڏيو (شڪل 4e) 17. اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته KAND 11 سيل جي واڌ کي روڪي ٿو سيل جي واڌ کي گهٽائڻ سان.
واڌ تي urbenonic acid derivatives (urbenyloxy derivatives) جي روڪٿام واري اثر جو تجزيو. (a) 7 ڏينهن پراڻا جهنگلي قسم جا Col ٻج جيڪي KAND 11 جي اشارو ڪيل ڪنسنٽريشن سان MS پليٽن تي پوکيا ويا آهن. اسڪيل بار = 1 سينٽي ميٽر. (b) روٽ جي ڊيگهه جو مقدار. اکر اهم فرق ظاهر ڪن ٿا (ٽوڪي HSD ٽيسٽ، پي.< 0.05). n>16. ڊيٽا کي سراسري ± SD طور ڏيکاريو ويو آهي. (c) پروپيڊيم آئوڊائيڊ سان داغدار جهنگلي قسم جي ڪول روٽ جي ڪنفوڪل مائڪروسڪوپي جيڪا 25 μM KAND سان يا ان کان سواءِ MS پليٽن تي وڌي وئي آهي 11. اڇا بریکٹ روٽ ميرسٽم کي ظاهر ڪن ٿا. اسڪيل بار = 100 μm. (d) روٽ ميرسٽم سائيز جي مقدار (n = 10 کان 11). شمارياتي فرق ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪندي طئي ڪيا ويا (p< 0.05). بار اوسط ميرسٽم سائيز جي نمائندگي ڪن ٿا. (e) CDKB2 ڪنسٽرڪٽ تي مشتمل روٽ ميرسٽم جي ڊفرنشل انٽرفيرنس ڪنٽراسٽ (DIC) مائڪروسڪوپي؛ 1pro: CDKB2؛ 25 µM KAND ايسي سان يا ان کان سواءِ MS پليٽن تي پوکيل 5 ڏينهن جي ٻج تي 1-GUS داغدار ۽ داغدار.
KAND 11 جي فائٽوٽوڪسيسيٽي کي هڪ ٻئي ڊائيٽيلڊونس ٻوٽي، تمباکو (نڪوٽيانا ٽيباڪم)، ۽ هڪ وڏي زميني ٻوٽي جي ماڊل آرگنزم، ليورورٽ (مارچينٽيا پوليمورفا) استعمال ڪندي وڌيڪ جانچيو ويو. جيئن ته عربيڊوپسس جي صورت ۾، 25 μM KAND 11 تي پوکيل تمباکو SR-1 ٻج ننڍا جڙ پيدا ڪيا (شڪل 5a). اضافي طور تي، 48 مان 40 ٻج 200 μM KAND 11 تي مشتمل پليٽن تي اُڀريا، جڏهن ته سڀئي 48 ٻج ٺٺولي سان علاج ٿيل ميڊيا تي اُڀريا، اهو ظاهر ڪري ٿو ته KAND جي وڌيڪ ڪنسنٽريشن اهم هئي (p< 0.05؛ چي ٽيسٽ - اسڪوائر) تمباکو جي ڄمڻ کي روڪيو. (شڪل 5b). ان کان علاوه، KAND 11 جو ڪنسنٽريشن جيڪو ليورورٽ ۾ بيڪٽيريا جي واڌ کي روڪي ٿو، اهو Arabidopsis (شڪل 5c) ۾ اثرائتي ڪنسنٽريشن جي برابر هو. اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته KAND 11 مختلف قسمن جي ٻوٽن جي واڌ کي روڪي سگهي ٿو. پوءِ اسان ٻين جاندارن ۾، يعني انساني HeLa سيلز ۽ Escherichia coli strain DH5α ۾، بيئر مونوامائيڊ سان لاڳاپيل مرکبات جي ممڪن سائيٽوٽوڪسيسيٽي جي تحقيق ڪئي، جيئن ته اعلي جانورن ۽ بيڪٽيريا سيلز جي نمائندگي، ترتيب وار. سيل جي واڌ ويجهه جي جاچ جي هڪ سلسلي ۾، اسان ڏٺو ته ڪومامونامائيڊ 1، ڪومامونامائيڊڪ ايسڊ 6، ۽ KAND 11 100 μM جي ڪنسنٽريشن تي HeLa يا E. coli سيلز جي واڌ کي متاثر نه ڪيو (شڪل 5d، e).
غير عربيڊوپسس جاندارن ۾ ڪي اين ڊي 11 جي واڌ کي روڪيو. (الف) ٻه هفتا پراڻا جهنگلي قسم جي ايس آر-1 تمباکو جا ٻج عمودي طور تي رکيل ايم ايس پليٽن تي پوکيا ويا جن ۾ 25 μM ڪي اين ڊي 11 شامل هئا. (ب) ٻه هفتا پراڻا جهنگلي قسم جي ايس آر-1 تمباکو جا ٻج افقي طور تي رکيل ايم ايس پليٽن تي پوکيا ويا جن ۾ 200 μM ڪي اين ڊي 11 شامل هئا. (ج) ٻه هفتا پراڻا جهنگلي قسم جي ٽاڪ-1 ليورورٽ بڊز جيڪي ڪي اين ڊي 11 جي اشارو ڪيل ڪنسنٽريشن سان گيمبورگ بي 5 پليٽن تي پوکيا ويا. ڳاڙهي تير انهن اسپورن کي ظاهر ڪن ٿا جيڪي ٻن هفتن جي انڪيوبيشن دور ۾ وڌڻ بند ڪري ويا. (ڊي) هيلا سيلز جي سيل پروپليريشن ايسي. سيل ڳڻپ ڪٽ 8 (ڊوجينڊو) استعمال ڪندي مقرر وقت جي وقفن تي قابل عمل سيلز جي تعداد جي ماپ ڪئي وئي. ڪنٽرول جي طور تي، هيلا سيلز کي 5 μg/ml ايڪٽينومائسن ڊي (ايڪٽ ڊي) سان علاج ڪيو ويو، جيڪو آر اين اي پوليمريز ٽرانسڪرپشن کي روڪي ٿو ۽ سيل جي موت جو سبب بڻجي ٿو. تجزيا ٽن نقلن ۾ ڪيا ويا. (اي) اي ڪولي سيل پروپليريشن ايسي. اي ڪولي جي واڌ جو تجزيو OD600 جي ماپ ڪري ڪيو ويو. ڪنٽرول جي طور تي، سيلز کي 50 μg/ml ايمپيسيلين (Amp) سان علاج ڪيو ويو، جيڪو بيڪٽيريا جي سيل وال جي جوڙجڪ کي روڪي ٿو. تجزيا ٽن نقلن ۾ ڪيا ويا.
يورامائيڊ سان لاڳاپيل مرڪبن جي ڪري سائٽوٽوڪسيسيٽي جي عمل جي ميڪانيزم کي سمجهڻ لاءِ، اسان وچولي روڪڻ واري اثرن سان يوربينڪ ايسڊ ڊيريويٽوز جو ٻيهر تجزيو ڪيو. جيئن تصوير ۾ ڏيکاريل آهي. جيئن شڪل 2b، 6a ۾ ڏيکاريل آهي، آگر پليٽن تي پوکيل ٻج جيڪي يورمٽونڪ ايسڊ 6 جي اعليٰ ڪنسنٽريشن (200 μM) تي مشتمل آهن، ننڍا ۽ کاٻي مڙيل جڙ پيدا ڪيا (θ = – 23.7 ± 6.1)، جڏهن ته ڪنٽرول ميڊيم تي پوکيل ٻج مان، ٻج تقريبن سڌي جڙ پيدا ڪئي (θ = – 3.8 ± 7.1). هي خاصيت وارو ترچھو واڌ ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس 14,18 جي ​​خرابي جي نتيجي ۾ معلوم ٿئي ٿو. هن ڳولا سان مطابقت رکندڙ، مائڪروٽيوبولس کي غير مستحڪم ڪرڻ واريون دوائون ڊسپوپائرامائيڊ ۽ اوريزالائن اسان جي واڌ جي حالتن ۾ ساڳي جڙ جي جھلڪ کي متاثر ڪيو (شڪل 2b، 6a). ساڳئي وقت، اسان يورمٽونڪ ايسڊ ڊيريويٽوز جي جانچ ڪئي ۽ انهن مان ڪيترن کي چونڊيو جيڪي، ڪجهه ڪنسنٽريشن تي، ترچھو جڙ جي واڌ کي متاثر ڪيو. مرڪب 8، 9، ۽ 15 ترتيب وار 75 μM، 50 μM، ۽ 40 μM تي جڙ جي واڌ جي هدايت کي تبديل ڪيو، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته اهي مرڪب مائڪروٽيوبلز کي مؤثر طريقي سان غير مستحڪم ڪري سگهن ٿا (شڪل 2b، 6a). اسان گهٽ ڪنسنٽريشن (15 μM) تي سڀ کان وڌيڪ طاقتور ursolic acid derivative، KAND 11 کي پڻ آزمايو ۽ ڏٺو ته KAND 11 جي استعمال جڙ جي واڌ کي روڪيو ۽ جڙ جي واڌ جي هدايت غير مساوي هئي، جيتوڻيڪ اهي کاٻي پاسي سلپ ڏانهن رجحان رکن ٿا (شڪل C3). ڇاڪاڻ ته مائڪروٽيوبيو کي غير مستحڪم ڪرڻ واري دوائن جي وڌيڪ ڪنسنٽريشن ڪڏهن ڪڏهن جڙ جي جھڪڻ جي بدران ٻوٽن جي واڌ کي روڪي ٿي، اسان بعد ۾ ان امڪان جو جائزو ورتو ته KAND 11 جڙ جي ايپيڊرمل سيلز ۾ ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبلز کي ڏسي مائڪروٽيوبلز کي متاثر ڪري ٿو. 25 μM KAND 11 سان علاج ڪيل ٻج جي پاڙن جي ايپيڊرمل سيلز ۾ اينٽي-β-ٽيوبلين اينٽي باڊيز استعمال ڪندي امونوهسٽو ڪيمسٽري ايلونگيشن زون ۾ ايپيڊرمل سيلز ۾ تقريبن سڀني ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبلز جي غائب ٿيڻ کي ظاهر ڪيو (شڪل 6b). اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته ڪوماموٽونک ايسڊ ۽ ان جا ڊيريويٽوز مائڪروٽيوبلز تي سڌي يا اڻ سڌي طرح ڪم ڪن ٿا انهن کي خراب ڪرڻ لاءِ ۽ اهي مرڪب نوان مائڪروٽيوبيل انابيٽر آهن.
ارسونڪ ايسڊ ۽ ان جا نڪتل Arabidopsis thaliana ۾ ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبلز کي تبديل ڪن ٿا. (a) جڙ جي جھڪاءُ جو زاويه مختلف ارموٽونڪ ايسڊ نڪتلن جي موجودگي ۾ ماپيل ڪنسنٽريشن تي. مائڪروٽيوبلز کي روڪڻ لاءِ سڃاتل ٻن مرکبن جا اثر: ڊسوپائرامائيڊ ۽ اوريزالين پڻ تجزيو ڪيا ويا. انسيٽ جڙ جي واڌ جي زاويه کي ماپڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ معيار کي ڏيکاري ٿو. نجما شيم علاج سان اهم فرق ظاهر ڪن ٿا (ٽي ٽيسٽ، پي< 0.05). n>19. اسڪيل بار = 1 سينٽي ميٽر. (ب) ايلونگيشن زون ۾ ايپيڊرمل سيلز ۾ ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبلز. جهنگلي قسم جي عربيڊوپسس ڪول روٽ ۾ مائڪروٽيوبلز جيڪي 25 μM KAND 11 سان يا ان کان سواءِ MS پليٽن تي پوکيا ويا هئا، انهن کي β-ٽيوبلين پرائمري اينٽي باڊيز ۽ Alexa فلور-ڪنجوگيٽڊ سيڪنڊري اينٽي باڊيز استعمال ڪندي امونوهسٽو ڪيميڪل اسٽيننگ ذريعي ڏٺو ويو. اسڪيل بار = 10 μm. (ج) روٽ ميرسٽم ۾ مائڪروٽيوبلز جي مائيٽوٽڪ structure. مائڪروٽيوبلز کي اميونوهسٽو ڪيميڪل اسٽيننگ استعمال ڪندي ڏٺو ويو. مائيٽوٽڪ structuresانچي، جنهن ۾ پروفيس زون، اسپنڊل، ۽ فراگموپلاسٽس شامل آهن، ڪنفوڪل تصويرن مان ڳڻيا ويا. تير مائيٽوٽڪ مائڪروٽيوبولس structuresانچي کي ظاهر ڪن ٿا. ستارا شيم علاج سان اهم فرق ظاهر ڪن ٿا (ٽي ٽيسٽ، پي< 0.05). n>9. اسڪيل بار = 50 µm.
جيتوڻيڪ ارسا ۾ مائڪروٽيوبول جي ڪم ۾ خلل وجهڻ جي صلاحيت آهي، پر ان جي عمل جو طريقو عام مائڪروٽيوبول ڊيپوليمرائيزنگ ايجنٽن کان مختلف هجڻ جي اميد آهي. مثال طور، مائڪروٽيوبول ڊيپوليمرائيزنگ ايجنٽن جهڙوڪ ڊسوپائرامائيڊ ۽ اوريزالائن جي وڌيڪ ڪنسنٽريشن ايپيڊرمل سيلز جي اينيسوٽروپڪ توسيع کي متاثر ڪن ٿا، جڏهن ته KAND 11 ائين نٿو ڪري. ان کان علاوه، KAND 11 ۽ ڊسوپائرامائيڊ جي گڏيل استعمال جي نتيجي ۾ گڏيل ڊسوپائرامائيڊ-حوصلہ افزائي جڙ جي واڌ جي رد عمل ۽ KAND 11-حوصلہ افزائي واڌ جي روڪٿام جو مشاهدو ڪيو ويو (شڪل S4). اسان هائپر حساس ڊسوپائرامائيڊ 1-1 (phs1-1) ميوٽنٽ جي KAND 11 جي جواب جو پڻ تجزيو ڪيو. phs1-1 ۾ هڪ غير ڪيننيڪل ٽيوبلين ڪائنس پوائنٽ ميوٽيشن آهي ۽ جڏهن ڊسوپائرامائيڊ 9,20 سان علاج ڪيو ويندو آهي ته ننڍيون جڙ پيدا ڪري ٿو. phs1-1 ميوٽنٽ ٻج جيڪي KAND 11 تي پوکيا ويندا آهن انهن جون پاڙون ننڍيون هونديون آهن جيڪي ڊسوپائرامائيڊ تي پوکيا ويندا آهن (شڪل S5).
ان کان علاوه، اسان KAND 11 سان علاج ڪيل ٻج جي روٽ ميرسٽم ۾ مائيٽوٽڪ مائڪروٽيوبولس جي جوڙجڪ، جهڙوڪ پروفيس زون، اسپنڊل، ۽ فراگموپلاسٽس جو مشاهدو ڪيو. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS جي مشاهدن سان مطابقت، مائيٽوٽڪ مائڪروٽيوبولس جي تعداد ۾ هڪ اهم گهٽتائي ڏٺي وئي (شڪل .6c).
سب سيلولر ريزوليوشن تي KAND 11 جي سائيٽوٽوڪسيسيٽي کي نمايان ڪرڻ لاءِ، اسان تمباکو BY-2 معطلي سيلز کي KAND 11 سان علاج ڪيو ۽ انهن جي جواب جو مشاهدو ڪيو. اسان پهريون ڀيرو KAND 11 کي BY-2 سيلز ۾ شامل ڪيو جيڪو TagRFP-TUA6 کي ظاهر ڪري ٿو، جيڪو فلوروسينٽلي طور تي مائڪروٽيوبلز کي ليبل ڪري ٿو، ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبلز تي KAND 11 جي اثر جو جائزو وٺڻ لاءِ. ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس کثافت جو جائزو تصوير جي تجزيي کي استعمال ڪندي ڪيو ويو، جيڪو سائيٽوپلاسمڪ پکسلز جي وچ ۾ سائيٽوسڪيليٽل پکسلز جي سيڪڙو کي مقدار ۾ مقرر ڪيو. امتحان جي نتيجن مان ظاهر ٿيو ته 1 ڪلاڪ لاءِ 50 μM يا 100 μM KAND 11 سان علاج ڪرڻ کان پوءِ، کثافت خاص طور تي گهٽجي 0.94 ± 0.74٪ يا 0.23 ± 0.28٪ ٿي وئي، جڏهن ته DMSO سان علاج ڪيل سيلز جي کثافت، 1.61 ± 0.34٪ (شڪل 7a) هئي. اهي نتيجا Arabidopsis ۾ مشاهدي سان مطابقت رکن ٿا ته KAND 11 علاج ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبلز جي ڊيپوليمرائيزيشن کي متاثر ڪري ٿو (شڪل 6b). اسان KAND 11 جي ساڳئي ڪنسنٽريشن سان علاج کان پوءِ GFP-ABD-ليبل ٿيل ايڪٽين فليمنٽس سان BY-2 لائن جو پڻ جائزو ورتو ۽ ڏٺو ته KAND 11 علاج ايڪٽين فليمنٽس کي خراب ڪيو. 50 μM يا 100 μM KAND 11 سان 1 ڪلاڪ لاءِ علاج سان ايڪٽين فليمنٽس جي کثافت کي بالترتيب 1.20 ± 0.62٪ يا 0.61 ± 0.26٪ تائين گهٽائي ڇڏيو، جڏهن ته DMSO-علاج ٿيل سيلز ۾ کثافت 1.69 ± 0.51٪ هئي (شڪل 2). 7b). اهي نتيجا پروپيزامائيڊ جي اثرات سان متضاد آهن، جيڪو ايڪٽين فليمنٽس کي متاثر نٿو ڪري، ۽ ليٽرونڪولين B، هڪ ايڪٽين ڊيپوليمرائزر جيڪو مائڪروٽيوبلز کي متاثر نٿو ڪري (SI شڪل S6). ان کان علاوه، ڪومامونامائيڊ 1، ڪومامونامائيڊ ايسڊ 6، يا ڪي اين ڊي 11 سان علاج هيلا سيلز ۾ مائڪروٽيوبولس کي متاثر نه ڪيو (SI شڪل S7). ان ڪري، ڪي اين ڊي 11 جي عمل جو طريقو ڄاتل سڃاتل سائيٽوسڪيلٽن ڊسڪٽرز کان مختلف سمجهيو ويندو آهي. ان کان علاوه، ڪي اين ڊي 11 سان علاج ڪيل BY-2 سيلز جي اسان جي خوردبيني مشاهدي ڪي اين ڊي 11 علاج دوران سيل جي موت جي شروعات کي ظاهر ڪيو ۽ ڏيکاريو ته ايوانز نيري داغدار مئل سيلز جو تناسب ڪي اين ڊي 11 علاج جي 30 منٽن کان پوءِ خاص طور تي نه وڌيو، جڏهن ته 50 μM يا 100 μM ڪي اين ڊي سان علاج جي 90 منٽن کان پوءِ، مئل سيلز جو تعداد ترتيب وار 43.7٪ يا 80.1٪ تائين وڌي ويو (شڪل 7c). گڏ ڪيو ويو، اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته ناول يورسولڪ ايسڊ ڊيريويٽو ڪي اين ڊي 11 هڪ ٻوٽي جي مخصوص سائيٽوسڪيليٽل انبيٽر آهي جنهن جي عمل جو اڳ ۾ نامعلوم ميڪانيزم آهي.
KAND ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبلز، ايڪٽين فليمنٽس، ۽ تمباکو BY-2 سيلز جي عملداري کي متاثر ڪري ٿو. (a) TagRFP-TUA6 جي موجودگي ۾ BY-2 سيلز ۾ ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبلز جو تصور. KAND 11 (50 μM يا 100 μM) يا DMSO سان علاج ڪيل BY-2 سيلز کي ڪنفوڪل مائڪروسڪوپي ذريعي جانچيو ويو. ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس جي کثافت 25 آزاد سيلز جي مائڪروگرافس مان ڳڻپيو ويو. خط اهم فرق ظاهر ڪن ٿا (ٽوڪي HSD ٽيسٽ، پي< 0.05). اسڪيل بار = 10 µm. (b) GFP-ABD2 جي موجودگي ۾ BY-2 سيلز ۾ ڪارٽيڪل ايڪٽين فليمينٽس. KAND 11 (50 μM يا 100 μM) يا DMSO سان علاج ڪيل BY-2 سيلز کي ڪنفوڪل مائڪروسڪوپي ذريعي جانچيو ويو. ڪارٽيڪل ايڪٽين فليمينٽس جي کثافت 25 آزاد سيلز جي مائڪروگرافس مان ڳڻيو ويو. خط اهم فرق ظاهر ڪن ٿا (ٽوڪي HSD ٽيسٽ، پي< 0.05). اسڪيل بار = 10 µm. (c) ايونز بليو اسٽيننگ ذريعي مئل BY-2 سيلز جو مشاهدو. KAND 11 (50 μM يا 100 μM) يا DMSO سان علاج ڪيل BY-2 سيلز کي روشن فيلڊ مائڪروسڪوپي ذريعي جانچيو ويو. n = 3. اسڪيل بار = 100 µm.
نئين قدرتي شين جي دريافت ۽ استعمال انساني زندگي جي مختلف پهلوئن ۾ اهم ترقي ڪئي آهي، جنهن ۾ طب ۽ زراعت شامل آهن. قدرتي وسيلن مان مفيد مرڪب حاصل ڪرڻ لاءِ تاريخي تحقيق ڪئي وئي آهي. خاص طور تي، ايڪٽينومائسيٽس کي نيماٽوڊس لاءِ اينٽي پيراسائيٽڪ اينٽي بايوٽڪ طور مفيد سمجهيو ويندو آهي ڇاڪاڻ ته انهن جي صلاحيت مختلف ثانوي ميٽابولائٽس جهڙوڪ ايورميڪٽين، آئيورميڪٽين ۽ بليوميسن جو ليڊ مرڪب ۽ ان جا ڊيريويٽو پيدا ڪرڻ جي صلاحيت آهي، جيڪي دوائن ۾ ڪينسر جي خلاف ايجنٽ طور استعمال ڪيا ويندا آهن21,22. ساڳئي طرح، ايڪٽينومائسيٽس مان مختلف قسم جا جڙي ٻوٽين جا مرڪب دريافت ڪيا ويا آهن، جن مان ڪجهه اڳ ۾ ئي تجارتي طور تي استعمال ڪيا ويا آهن1,23. تنهن ڪري، قدرتي شين کي گهربل حياتياتي سرگرمين سان الڳ ڪرڻ لاءِ ايڪٽينومائسيٽ ميٽابولائٽس جو تجزيو هڪ مؤثر حڪمت عملي سمجهيو ويندو آهي. هن مطالعي ۾، اسان ايس. ويرائنسس مان هڪ نئون مرڪب، ڪومامونامائيڊ، دريافت ڪيو ۽ ان کي ڪاميابي سان گڏ ڪيو. ارسونڪ ايسڊ urbenamide ۽ ان جي ڊيريويٽوز جو هڪ مصنوعي وچولي آهي. اهو خاصيت واري جڙي ٻوٽين جي ڪرلنگ جو سبب بڻجي سگهي ٿو، وچولي کان مضبوط جڙي ٻوٽي جي سرگرمي ڏيکاري ٿو، ۽ سڌي يا اڻ سڌي طرح ٻوٽي جي مائڪروٽيوبلز کي نقصان پهچائي سگهي ٿو. جڏهن ته، ارموٽونڪ ايسڊ جي عمل جو طريقو موجوده مائڪروٽيوبول انبيٽرز کان مختلف ٿي سگهي ٿو، ڇاڪاڻ ته KAND 11 ايڪٽين فليمينٽس کي به خراب ڪري ٿو ۽ سيل جي موت جو سبب بڻجي ٿو، هڪ ريگيوليٽري ميڪانيزم جو مشورو ڏئي ٿو جنهن ذريعي ارموٽونڪ ايسڊ ۽ ان جا ڊيريويٽوز سائيٽوسڪيليٽل ڍانچي جي وسيع رينج کي متاثر ڪن ٿا. .
urbenonic acid جي وڌيڪ تفصيلي خاصيت urbenonic acid جي عمل جي ميڪانيزم کي بهتر سمجهڻ ۾ مدد ڪندي. خاص طور تي، ايندڙ مقصد ursonic acid جي گھٽيل مائڪروٽيوبلز سان ڳنڍڻ جي صلاحيت جو جائزو وٺڻ آهي ته جيئن اهو طئي ڪري سگهجي ته ڇا ursonic acid ۽ ان جا نڪتل سڌو سنئون مائڪروٽيوبلز تي ڪم ڪن ٿا ۽ انهن کي ڊيپوليمرائيز ڪن ٿا، يا ڇا انهن جي عمل جي نتيجي ۾ مائڪروٽيوبلز جي عدم استحڪام پيدا ٿئي ٿي. ان کان علاوه، ان صورت ۾ جتي مائڪروٽيوبلز سڌو سنئون نشانو نه آهن، عمل جي جڳهه ۽ ٻوٽن جي سيلن تي ursonic acid جي ماليڪيولر هدفن جي سڃاڻپ لاڳاپيل مرکبات جي خاصيتن ۽ جڙي ٻوٽي جي سرگرمي کي بهتر بڻائڻ جي ممڪن طريقن کي وڌيڪ سمجهڻ ۾ مدد ڪندي. اسان جي بايو ايڪٽيويٽي ٽيسٽ ٻوٽن جي واڌ ويجهه تي ursonic acid جي منفرد سائيٽوٽوڪسڪ صلاحيت کي ظاهر ڪيو جهڙوڪ Arabidopsis thaliana، تمباکو ۽ liverwort، جڏهن ته نه ته E. coli ۽ نه ئي HeLa سيل متاثر ٿيا. جانورن جي سيلن لاءِ ٿوري يا ڪابه زهريت ursonic acid derivatives جو فائدو آهي جيڪڏهن انهن کي کليل زرعي ميدانن ۾ استعمال لاءِ جڙي ٻوٽي جي طور تي ترقي ڪئي وڃي. حقيقت ۾، جيئن ته مائڪروٽيوبلز يوڪريوٽس ۾ عام جوڙجڪ آهن، ٻوٽن ۾ انهن جي چونڊيل روڪٿام جڙي ٻوٽي جي دوائن لاءِ هڪ اهم ضرورت آهي. مثال طور، پروپيزامائيڊ، هڪ مائڪروٽيوبول ڊيپوليمرائيزنگ ايجنٽ جيڪو سڌو سنئون ٽيوبلين سان ڳنڍيل آهي ۽ پوليمرائيزيشن کي روڪي ٿو، جانورن جي سيلن لاءِ گهٽ زهر جي ڪري جڙي ٻوٽي جي طور تي استعمال ڪيو ويندو آهي 24. ڊسوپيرامائيڊ جي برعڪس، لاڳاپيل بينزامائيڊس ۾ مختلف ٽارگيٽ خاصيتون آهن. ٻوٽن جي مائڪروٽيوبولز کان علاوه، RH-4032 يا بينزومائيڊ پڻ جانورن جي سيلن يا اومائي سيٽس جي مائڪروٽيوبولز کي روڪي ٿو، ترتيب وار، ۽ زاليلامائيڊ کي ان جي گهٽ فائيٽوٽوڪسيسيٽي 25,26,27 جي ڪري فنگسائيڊ طور استعمال ڪيو ويندو آهي. نئون دريافت ٿيل رڇ ۽ ان جا نڪتل ٻوٽن جي خلاف چونڊيل سائيٽوٽوڪسيسيٽي ڏيکارين ٿا، پر اهو قابل ذڪر آهي ته وڌيڪ تبديليون انهن جي ٽارگيٽ خاصيت کي تبديل ڪري سگهن ٿيون، ممڪن طور تي پيٿوجينڪ فنگس يا اومائي سيٽس جي ڪنٽرول لاءِ اضافي نڪتل شيون مهيا ڪن ٿيون.
urbenonic acid ۽ ان جي نڪتن جون منفرد خاصيتون جڙي ٻوٽين جي دوائن جي طور تي انهن جي ترقي ۽ تحقيق جي اوزار طور استعمال لاءِ ڪارآمد آهن. ٻوٽن جي سيل جي شڪل کي ڪنٽرول ڪرڻ ۾ سائيٽوسڪيلٽن جي اهميت کي وڏي پيماني تي تسليم ڪيو ويو آهي. اڳوڻي مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته ٻوٽن مائڪروٽيوبول ڊائنامڪس کي ڪنٽرول ڪندي ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبول آرگنائيزيشن جي پيچيده ميڪانيزم کي ترقي ڪئي آهي ته جيئن مورفوجينيسس کي صحيح طور تي ڪنٽرول ڪري سگهجي. مائڪروٽيوبول سرگرمي جي ضابطي لاءِ ذميوار ماليڪيولز جي هڪ وڏي تعداد جي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي، ۽ لاڳاپيل تحقيق اڃا تائين جاري آهي 3,4,28. ٻوٽن جي سيلن ۾ مائڪروٽيوبول ڊائنامڪس جي اسان جي موجوده سمجھ ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبول آرگنائيزيشن جي ميڪانيزم کي مڪمل طور تي بيان نٿي ڪري. مثال طور، جيتوڻيڪ ڊسوپيرامائيڊ ۽ اوريزالين ٻئي مائڪروٽيوبولز کي ڊيپوليمرائيز ڪري سگهن ٿا، ڊسوپيرامائيڊ سخت جڙ جي خرابي جو سبب بڻجندو آهي جڏهن ته اوريزالين جو اثر نسبتاً نرم هوندو آهي. ان کان علاوه، ٽيوبلين ۾ ميوٽيشنز، جيڪو مائڪروٽيوبولز کي مستحڪم ڪري ٿو، جڙن ۾ ڊيڪسٽرروٽيشن جو سبب پڻ بڻجي ٿو، جڏهن ته پيڪليٽيڪسيل، جيڪو مائڪروٽيوبول ڊائنامڪس کي پڻ مستحڪم ڪري ٿو، اهو نٿو ڪري. تنهن ڪري، ارسولڪ ايسڊ جي ماليڪيولر هدفن جو مطالعو ۽ سڃاڻپ ڪرڻ سان ٻوٽن جي ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس جي ضابطي ۾ نئين بصيرت فراهم ڪرڻ گهرجي. ساڳئي طرح، مستقبل ۾ ڪيميڪلز جو مقابلو جيڪي مسخ ٿيل واڌ کي فروغ ڏيڻ ۾ اثرائتو آهن، جهڙوڪ ڊسوپائرامائيڊ، ۽ گهٽ اثرائتي ڪيميڪلز، جهڙوڪ اوريزالين يا ڪوما موٽرڪ ايسڊ، ان ڳالهه جو اشارو فراهم ڪندا ته مسخ ٿيل واڌ ڪيئن ٿيندي آهي.
ٻئي طرف، دفاع سان لاڳاپيل سائيٽوسڪيليٽل ٻيهر ترتيبون ارسونڪ ايسڊ جي سائيٽوٽوڪسيسيٽي کي بيان ڪرڻ لاءِ هڪ ٻيو امڪان آهن. ڪنهن پيٿوجن جو انفيڪشن يا ٻوٽن جي سيلن ۾ ايليڪٽر جو تعارف ڪڏهن ڪڏهن سائيٽوسڪيلٽن جي تباهي ۽ بعد ۾ سيل جي موت جو سبب بڻجندو آهي29. مثال طور، اوميسيٽ مان نڪتل ڪرپٽوڪسينٿن کي تمباکو سيل جي موت کان اڳ مائڪروٽيوبولس ۽ ايڪٽين فليمينٽس کي خراب ڪرڻ جي رپورٽ ڪئي وئي آهي، جيڪو ڪي اين ڊي علاج سان ٿئي ٿو30,31. يورسونڪ ايسڊ پاران پيدا ٿيندڙ دفاعي ردعمل ۽ سيلولر ردعمل جي وچ ۾ هڪجهڙائي اسان کي اهو تصور ڪرڻ تي مجبور ڪيو ته اهي عام سيلولر عملن کي متحرڪ ڪن ٿا، جيتوڻيڪ ڪرپٽوڪسينٿن جي ڀيٽ ۾ يورسونڪ ايسڊ جو تيز ۽ مضبوط اثر واضح آهي. بهرحال، مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته ايڪٽين فليمينٽس جي خرابي خود بخود سيل جي موت کي فروغ ڏئي ٿي، جيڪا هميشه مائڪروٽيوبولس جي خرابي سان گڏ نه هوندي آهي29. ان کان علاوه، اهو ڏسڻو آهي ته ڇا پيٿوجن يا ايليڪٽر جڙ جي خراب واڌ جو سبب بڻجن ٿا، جيئن يورسونڪ ايسڊ ڊيريويٽيوز ڪندا آهن. اهڙيءَ طرح، دفاعي ردعمل ۽ سائيٽوسڪيلٽن کي ڳنڍڻ وارو ماليڪيولر علم هڪ پرڪشش مسئلو آهي جنهن کي حل ڪيو وڃي. ارسونڪ ايسڊ سان لاڳاپيل گهٽ ماليڪيولر وزن واري مرکبات جي موجودگي جو استحصال ڪندي، ۽ انهي سان گڏ مختلف طاقتن سان گڏ ڊيريويٽوز جي هڪ حد، اهي نامعلوم سيلولر ميڪانيزم کي نشانو بڻائڻ جا موقعا فراهم ڪري سگهن ٿا.
گڏجي، نون مرڪبن جي دريافت ۽ استعمال جيڪي مائڪروٽيوبول ڊائنامڪس کي ماڊل ڪن ٿا، ٻوٽي جي سيل جي شڪل جي تعين جي بنياد تي پيچيده ماليڪيولر ميڪانيزم کي حل ڪرڻ لاءِ طاقتور طريقا فراهم ڪندا. هن حوالي سان، تازو ترقي يافته مرڪب ارموٽونڪ ايسڊ، جيڪو مائڪروٽيوبول ۽ ايڪٽين فليمينٽس کي متاثر ڪري ٿو ۽ سيل جي موت کي متاثر ڪري ٿو، مائڪروٽيوبول ڪنٽرول ۽ انهن ٻين ميڪانيزم جي وچ ۾ تعلق کي سمجهڻ جو موقعو فراهم ڪري سگهي ٿو. اهڙيءَ طرح، اربينونڪ ايسڊ استعمال ڪندي ڪيميائي ۽ حياتياتي تجزيو اسان کي ماليڪيولر ريگيوليٽري ميڪانيزم کي سمجهڻ ۾ مدد ڪندو جيڪي ٻوٽي جي سائيٽوسڪيلٽن کي ڪنٽرول ڪن ٿا.
ايس. ويرائنسس MK493-CF1 کي 500 ايم ايل جي حيران ڪندڙ ايرلن ميئر فلاسڪ ۾ داخل ڪريو جنهن ۾ 110 ايم ايل ٻج جو وچولي حصو شامل آهي جنهن ۾ 2٪ (w/v) گليڪٽوز، 2٪ (w/v) ايسنس پيسٽ، 1٪ (w/v) بيڪٽو ڪمپوزيشن شامل آهي. -سوئيٽن (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ، انڪارپوريٽڊ)، 0.5٪ (w/v) مکڻ جو عرق (KOGOSTCH ڪمپني، لميٽيڊ، جاپان)، 0.2٪ (w/v) (NH4)2SO4 ۽ 0.2٪ CaCO3 ڊيونائيزڊ پاڻي ۾. (پي ايڇ 7.4 جراثيم کان اڳ). ٻج ڪلچر کي روٽري شيڪر (180 آر پي ايم) تي 27 ° سي تي 2 ڏينهن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. سالڊ اسٽيٽ خمير ذريعي پيداوار جي پوک. ٻج ڪلچر (7 ملي ليٽر) کي 500 ملي ليٽر K-1 فلاسڪ ۾ منتقل ڪيو ويو جنهن ۾ 40 گرام پيداواري ميڊيم شامل هو جنهن ۾ 15 گرام پريس ٿيل جَو (MUSO ڪمپني لميٽيڊ، جاپان) ۽ 25 گرام ڊي آئنائيزڊ پاڻي (pH کي جراثيم کان اڳ ترتيب نه ڏنو ويو) شامل هو. خمير 14 ڏينهن تائين اونداهي ۾ 30 ° C تي ڪيو ويو. خمير مواد کي 40 ml/بوتل EtOH سان ڪڍيو ويو ۽ سينٽرفيوج ڪيو ويو (1500 g، 4 ° C، 10 منٽ). ڪلچر سپرنيٽينٽ (60 ml) کي 10٪ MeOH/EtOAc جي مرکب سان ڪڍيو ويو. نامياتي پرت کي گهٽ دٻاءُ هيٺ بخارات ذريعي خارج ڪيو ويو ته جيئن هڪ باقيات (59.5 ملي گرام) حاصل ڪري سگهجي، جنهن کي ريورس فيز ڪالم تي گريڊينٽ ايليوشن (0-10 منٽ: 90٪) سان HPLC جي تابع ڪيو ويو (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120، 5 μm، ID 10 ملي ميٽر × ڊيگهه 250 ملي ميٽر) H2O/CH3CN، 10-35 منٽ: 90٪ H2O/CH3CN کان 70٪ H2O/CH3CN (گريڊيئيٽ)، 35-45 منٽ: 90٪ H2O/EtOH، 45-155 منٽ: 90٪ H2O/EtOH کان 100٪ EtOH (گريڊيئيٽ (گريڊيئيٽ)، 155-200 منٽ: 100٪ EtOH) 1.5 ملي ليٽر/منٽ جي وهڪري جي شرح تي، ڪومامونامائيڊ (1، 36.0 ملي گرام) کي هڪ اڇي بي شڪل پائوڊر جي طور تي الڳ ڪيو ويو.
ڪوماموتوامائيڊ (1)؛ 1H-NMR (500 MHz، CDCl3) δ 6.93 (t، J = 2.5 Hz، 1H)، 6.76 (dd، J = 4.3، 1.8 Hz 1H)، 6.05 (t، J = 3.8 Hz، 1H).، 4.08 (s، 3H)؛ 13C-NMR (125 MHz، CDCl3) δ 161.1، 121.0، 119.9، 112.2، 105.0، 68.3؛ ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ حساب ڪيل قدر: 141.0659، ماپيل قدر: 141.0663، IR νmax 3451، 3414، 3173، 2938، 1603، 1593، 1537 cm–1.
ڪولمبيا جا ٻج (Col-0) Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) کان تحقيق جي استعمال جي اجازت سان حاصل ڪيا ويا. Col-0 جا ٻج اسان جي ليبارٽري جي حالتن ۾ پروپيگنڊا ۽ برقرار رکيا ويا ۽ جهنگلي قسم جي Arabidopsis ٻوٽن جي طور تي استعمال ڪيا ويا. Arabidopsis جا ٻج مٿاڇري تي جراثيم ڪش ڪيا ويا ۽ اڌ طاقت واري مراشيگ ۽ اسڪوگ ميڊيم ۾ ڪلچر ڪيا ويا جنهن ۾ 2٪ سوڪروز (Fujifilm Wako Pure Chemical)، 0.05٪ (w/v) 2-(4-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ۽ 1.5٪ آگر (Fujifilm Wako Pure Chemical)، pH 5.7، 23 °C ۽ مسلسل روشني تي شامل هئا. phs1-1 ميوٽنٽ جا ٻج T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) پاران مهيا ڪيا ويا.
SR-1 جا ٻج ٽي. هاشموٽو (نارا انسٽيٽيوٽ آف سائنس اينڊ ٽيڪنالاجي) پاران مهيا ڪيا ويا ۽ جهنگلي قسم جي تمباکو جي ٻوٽن طور استعمال ڪيا ويا. تمباکو جي ٻج کي مٿاڇري تي جراثيم کان پاڪ ڪيو ويو ۽ جراثيم کان پاڪ پاڻي ۾ ٽن راتين لاءِ ٻوڙي ڇڏيو ويو ته جيئن اُڀرڻ کي وڌايو وڃي، پوءِ هڪ اڌ طاقت واري محلول ۾ رکيو ويو جنهن ۾ 2٪ سوڪروز، 0.05٪ (w/v) MES، ۽ 0.8٪ گيلان گم (فوجي فلم واڪو پيور ڪيميڪل) مراشيگي ۽ اسڪوگ ميڊيم) pH 5.7 سان شامل هئا ۽ مسلسل روشني هيٺ 23°C تي انڪيوبيٽ ڪيا ويا.
اسٽرين ٽاڪ-1 ٽي. ڪوهچي (ڪيوٽو يونيورسٽي) پاران مهيا ڪئي وئي هئي ۽ ليورورٽ جي مطالعي لاءِ معياري تجرباتي يونٽ طور استعمال ڪئي وئي هئي. گيما کي جراثيم کان پاڪ ڪلچر ٿيل ٻوٽن مان حاصل ڪيو ويو ۽ پوءِ گيمبورگ بي 5 ميڊيم (فوجي فلم واڪو پيور ڪيميڪل) تي پليٽ ڪيو ويو جنهن ۾ 1٪ سوڪروز ۽ 0.3٪ گيلان گم شامل هئا ۽ مسلسل روشني هيٺ 23 ° C تي انڪيوب ڪيو ويو.
تمباکو BY-2 سيلز (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ايس. هاسيزاوا (ٽوڪيو يونيورسٽي) پاران مهيا ڪيا ويا. BY-2 سيلز کي تبديل ٿيل لنسميئر ۽ اسڪوگ ميڊيم ۾ 95 ڀيرا ملائي ڇڏيو ويو ۽ هفتيوار 2,4-ڊائيڪلوروفين آڪسائيٽڪ ايسڊ 32 سان گڏ ڪيو ويو. سيل سسپنشن کي روٽري شيڪر تي 130 rpm تي اونداهي ۾ 27 ° C تي ملايو ويو. سيلز کي تازي ميڊيم جي 10 ڀيرا حجم سان ڌوئڻ ۽ ساڳئي ميڊيم ۾ ٻيهر معطل ڪرڻ. BY-2 ٽرانسجينڪ سيل لائينون جيڪي مائڪروٽيوبيل مارڪر TagRFP-TUA6 يا ايڪٽين فليمينٽ مارڪر GFP-ABD2 کي ڪولي فلاور موزائيڪ وائرس 35S پروموٽر جي تحت مستحڪم طور تي ظاهر ڪن ٿيون، بيان ڪيل 33,34,35 جي مطابق پيدا ڪيون ويون. انهن سيل لائينن کي برقرار رکي سگهجي ٿو ۽ هم وقت سازي ڪري سگهجي ٿو اصل BY-2 سيل لائن لاءِ استعمال ٿيندڙ طريقن سان ملندڙ جلندڙ طريقا استعمال ڪندي.
هيلا سيلز کي ڊبلبيڪو جي تبديل ٿيل ايگل جي ميڊيم (DMEM) (لائف ٽيڪنالاجيز) ۾ ڪلچر ڪيو ويو، جنهن ۾ 10٪ فيٽل بووائن سيرم، 1.2 U/ml پينسلين، ۽ 1.2 μg/ml اسٽريپٽومائسن شامل هئا، هڪ 37°C انڪيوبيٽر ۾ 5٪ CO2 سان.
هن مسودي ۾ بيان ڪيل سڀئي تجربا جاپاني حياتياتي حفاظتي ضابطن ۽ هدايتن جي مطابق ڪيا ويا.
مرڪبن کي ڊائي ميٿائل سلفو آڪسائيڊ (DMSO؛ فوجي فلم واڪو پيور ڪيميڪل) ۾ اسٽاڪ محلول جي طور تي حل ڪيو ويو ۽ عربيڊوپسس ۽ تمباکو لاءِ MS ميڊيم يا ليورورٽ لاءِ گيمبورگ B5 ميڊيم ۾ ملائي ڇڏيو ويو. روٽ جي واڌ جي روڪٿام جي جاچ لاءِ، هر پليٽ تي 10 کان وڌيڪ ٻج اگار ميڊيم تي پوکيا ويا جنهن ۾ اشارو ڪيل مرکبات يا DMSO شامل هئا. ٻج کي 7 ڏينهن لاءِ واڌ جي چيمبر ۾ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. ٻج جي تصوير ڪڍي وئي ۽ جڙڙن جي ڊيگهه ماپي وئي. عربيڊوپسس جي ڄمڻ جي جاچ لاءِ، هر پليٽ تي 48 ٻج 200 μM مرڪب يا DMSO تي مشتمل آگار ميڊيم تي پوکيا ويا. عربيڊوپسس جي ٻج کي واڌ جي چيمبر ۾ پوکيو ويو ۽ ڄمڻ واري ٻج جي تعداد کي ڄمڻ کان 7 ڏينهن بعد ڳڻيو ويو (ڊيگ). تمباکو جي ڄمڻ جي جاچ لاءِ، هر پليٽ تي 24 ٻج اگار ميڊيم تي پوکيا ويا جنهن ۾ 200 μM KAND يا DMSO شامل هئا. تمباکو جا ٻج هڪ واڌ جي چيمبر ۾ پوکيا ويا ۽ ڄمڻ واري ٻج جي تعداد کي 14 ڏينهن کان پوءِ ڳڻيو ويو. ليورورٽ جي واڌ جي روڪٿام جي جاچ لاءِ، هر پليٽ مان 9 جنين کي آگر ميڊيم تي پليٽ ڪيو ويو جنهن ۾ KAND يا DMSO جي اشارو ڪيل ڪنسنٽريشن شامل هئي ۽ 14 ڏينهن تائين گروٿ چيمبر ۾ انڪيوبيٽ ڪيو ويو.
روٽ ميرسٽم تنظيم کي ڏسڻ لاءِ 5 mg/ml پروپيڊيم آئوڊائيڊ (PI) سان داغدار ٻج استعمال ڪريو. PI سگنلز کي فلوروسينس مائڪروسڪوپي ذريعي TCS SPE ڪنفوڪل ليزر اسڪيننگ مائڪروسڪوپ (Leica Microsystems) استعمال ڪندي ڏٺو ويو.
مالامي ۽ بينفي 36 پاران بيان ڪيل پروٽوڪول مطابق β-گلوڪورونائيڊيس (GUS) سان جڙن جي هسٽو ڪيميڪل اسٽيننگ ڪئي وئي. ٻج کي رات جو 90٪ ايسٽون ۾ لڳايو ويو، 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid سان GUS بفر ۾ 1 ڪلاڪ لاءِ داغ ڏنو ويو ۽ هڪ هائيڊريٽ ٿيل ڪلورالڊيهائيڊ محلول ۾ رکيو ويو. (8 گرام ڪلورل هائيڊريٽ، 2 ملي پاڻي ۽ 1 ملي گليسرول) ۽ ايڪسيو ايميجر M1 مائڪروسڪوپ (ڪارل زيس) استعمال ڪندي ڊفرنشل انٽرفيرنس ڪنٽراسٽ مائڪروسڪوپي ذريعي مشاهدو ڪيو ويو.
عمودي طور تي رکيل پليٽن تي پوکيل 7 ڏينهن جي ٻج تي پاڙن جي زاوين کي ماپيو ويو. قدم 6 ۾ بيان ڪيل ڪشش ثقل ویکٹر جي هدايت کان پاڙ جي زاوي کي ماپيو.
ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبلز جي ترتيب کي بيان ڪيل طور تي ڏٺو ويو، پروٽوڪول 37 ۾ معمولي تبديلين سان. اينٽي-β-ٽيوبلين اينٽي باڊي (KMX-1، مرڪ مليپور: MAB3408) ۽ Alexa فلور 488-ڪنجوگيٽڊ اينٽي ماؤس IgG (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ: A32723) کي ترتيب وار 1:1000 ۽ 1:100 ڊائليشن تي پرائمري ۽ سيڪنڊري اينٽي باڊيز طور استعمال ڪيو ويو. فلوروسينس تصويرون TCS SPE ڪنفوڪل ليزر اسڪيننگ مائڪروسڪوپ (ليڪا مائڪرو سسٽم) استعمال ڪندي حاصل ڪيون ويون. Z-اسٽيڪ تصويرون حاصل ڪريو ۽ ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق وڌ ۾ وڌ شدت جا پروجئشن ٺاهيو.
هيلا سيل پروليفريشن ايسي ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق سيل ڪائونٽنگ ڪٽ 8 (ڊوجينڊو) استعمال ڪندي ڪئي وئي.
اي ڪولي DH5α جي واڌ جو تجزيو ڪلچر ۾ سيل جي کثافت کي ماپڻ سان 600 nm (OD600) تي اسپيڪٽرو فوٽوميٽر استعمال ڪندي ڪيو ويو.
ٽرانسجينڪ BY-2 سيلز ۾ سائيٽوسڪيليٽل تنظيم کي CSU-X1 ڪنفوڪل اسڪيننگ ڊيوائس (يوڪوگاوا) ۽ هڪ sCMOS ڪئميرا (زائلا، اينڊور ٽيڪنالاجي) سان ليس فلوروسينس مائڪروسڪوپ استعمال ڪندي ڏٺو ويو. سائيٽوسڪيليٽل کثافت جو جائزو تصوير جي تجزيي ذريعي ڪيو ويو، جنهن ImageJ سافٽ ويئر استعمال ڪندي ڪنفوڪل تصويرن ۾ سائيٽوسڪيليٽل پکسلز جي فيصد کي مقدار ۾ رکيو جيئن بيان ڪيو ويو آهي 38,39.
BY-2 سيلز ۾ سيل ڊيٿ کي ڳولڻ لاءِ، سيل سسپنشن جي هڪ الڪواٽ کي ڪمري جي حرارت تي 10 منٽن لاءِ 0.05٪ ايوانز بليو سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو. مئل سيلز جو چونڊيل ايوانز بليو اسٽيننگ برقرار پلازما جھلي 40 ذريعي قابل عمل سيلز مان رنگ جي اخراج تي منحصر آهي. روشن فيلڊ مائڪروسڪوپ (BX53، اولمپس) استعمال ڪندي داغدار سيلز جو مشاهدو ڪيو ويو.
هيلا سيلز کي DMEM ۾ 10٪ FBS سان گڏ هڪ نمي واري انڪيوبيٽر ۾ 37 ° C ۽ 5٪ CO2 تي وڌايو ويو. سيلز کي 100 μM KAND 11، ڪومامونامڪ ايسڊ 6، ڪومامونامائيڊ 1، 100 ng/ml ڪولسيمڊ (گبڪو)، يا 100 ng/ml نوڪوڊميز (سگما) سان 37 ° C تي 6 ڪلاڪن لاءِ علاج ڪيو ويو. سيلز کي MetOH سان 10 منٽن لاءِ ۽ پوءِ ڪمري جي حرارت تي 5 منٽن لاءِ ايسٽيٽ سان مقرر ڪيو ويو. مقرر سيلز کي β-ٽيوبلين پرائمري اينٽي باڊي (1D4A4، پروٽين ٽيڪ: 66240-1) سان 0.5٪ BSA/PBS ۾ 2 ڪلاڪن لاءِ ملائي انڪيوبيٽ ڪيو ويو، TBST سان 3 ڀيرا ڌوئي، ۽ پوءِ Alexa Fluor بکري اينٽي باڊي سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو. 488 1 ڪلاڪ. - ماؤس IgG (ٿرمو فشر سائنٽيفڪ: A11001) ۽ 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.5% BSA/PBS ۾ ملائي. ٽي ڀيرا TBST سان ڌوئڻ کان پوءِ، Nikon Eclipse Ti-E انورٽڊ مائڪروسڪوپ تي داغدار سيلز ڏٺا ويا. تصويرون ميٽا مورف سافٽ ويئر (ماليڪيولر ڊيوائسز) استعمال ڪندي ٿڌي Hamamatsu ORCA-R2 CCD ڪئميرا سان قبضو ڪيون ويون.