Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.توھان استعمال ڪري رھيا آھيو برائوزر جو نسخو محدود CSS سپورٽ آھي.بهترين نتيجن لاءِ، اسان صلاح ڏيون ٿا ته توهان پنهنجي برائوزر جو نئون ورزن استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).ساڳئي وقت ۾، جاري حمايت کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل يا جاوا اسڪرپٽ ڏيکاري رهيا آهيون.
قدرتي شين جي دريافت ۽ فائدي واري استعمال انساني زندگي کي بهتر بنائڻ ۾ مدد ڪري سگهي ٿي.ٻوٽن جي واڌ ويجهه واري ڪيميا کي وڏي پيماني تي استعمال ڪيو ويندو آهي جڙي ٻوٽي کي ڪنٽرول ڪرڻ لاءِ.جڙي ٻوٽين جي مختلف قسمن کي استعمال ڪرڻ جي ضرورت جي ڪري، عمل جي نئين ميکانيزم سان مرکبات کي سڃاڻڻ جي ضرورت آهي.هن مطالعي ۾، اسان دريافت ڪيو هڪ ناول N -alkoxypyrrole مرڪب، coumamonamide، Streptomyces werraensis MK493-CF1 مان ۽ مڪمل ٺهڪندڙ عمل کي قائم ڪيو.حياتياتي سرگرمي جي جائزي جي ذريعي، اسان دريافت ڪيو ته urs-monoamic acid urs-monoamide جو هڪ مصنوعي وچولي آهي ۽ هڪ امڪانيٻوٽي جي واڌ inhibitor.ان کان علاوه، اسان مختلف urbenonic acid derivatives ٺاهيا آهن، جن ۾ urbenyloxy derivative (UDA) شامل آهن، جن ۾ HeLa سيلز جي واڌ تي منفي اثر انداز ٿيڻ کان سواءِ اعلي جڙي ٻوٽي جي سرگرمي آهي.اسان اهو پڻ ڏٺو آهي ته urmotonic acid derivatives ٻوٽن جي مائڪروٽيوبولس کي خراب ڪن ٿا.ان کان علاوه، KAND actin filaments کي متاثر ڪري ٿو ۽ سيل جي موت کي متاثر ڪري ٿو.اهي گهڻ رخا اثر سڃاتل microtubule inhibitors کان مختلف آهن ۽ ursonic acid لاءِ عمل جو هڪ نئون ميکانيزم پيش ڪن ٿا، جيڪو نئين جڙي ٻوٽين جي ترقيءَ ۾ اهم فائدي جي نمائندگي ڪري ٿو.
فائدي واري قدرتي شين جي دريافت ۽ عملي درخواست ۽ انهن مان نڪتل شيون انساني زندگي جي معيار کي بهتر بڻائڻ جو هڪ ذريعو آهي.مائڪروجنزم، ٻوٽن ۽ حشرات پاران پيدا ٿيندڙ ثانوي ميٽابولائٽس دوا ۽ زراعت ۾ وڏي ترقي جو سبب بڻيا آهن.ڪيتريون ئي اينٽي بايوٽيڪٽس ۽ اينٽي ليوڪيميا دوائون قدرتي شين مان ٺاهيا ويا آهن.ان کان علاوه، مختلف قسم جاجراثيم ڪش, fungicides ۽ herbicides انهن قدرتي شين مان ڪڍيا ويا آهن زراعت ۾ استعمال لاء.خاص طور تي، Weed control herbicides جديد زراعت ۾ فصلن جي پيداوار وڌائڻ لاءِ اھم اوزار آھن، ۽ مختلف قسم جا مرڪب اڳ ۾ ئي تجارتي طور استعمال ڪيا ويا آھن.ٻوٽن ۾ ڪيترائي سيلولر عمل، جھڙوڪ فوٽو سنٿيسس، امينو ايسڊ ميٽابولزم، سيل وال سنٿيسس، ريگيوليشن آف مائيٽوسس، فيٽو هارمون سگنلنگ، يا پروٽين جي سنٿيسس، کي ھيبائڊسز جا عام ھدف سمجھيا ويندا آھن.اهي مرڪب جيڪي مائڪروٽيوبول جي ڪم کي روڪيندا آهن اهي هيبائڊس جو هڪ عام طبقو آهن جيڪي ٻوٽن جي واڌ کي متاثر ڪري mitotic ريگيوليشن 2 کي متاثر ڪن ٿا.
Microtubules cytoskeleton جا جزا آهن ۽ وڏي پيماني تي eukaryotic خاني ۾ محفوظ آهن.tubulin heterodimer α-tubulin ۽ β-tubulin تي مشتمل آهي لڪير microtubule protofilaments ٺاهيندي، 13 protofilaments سان گڏ هڪ سلنڈر جي جوڙجڪ ٺاهي ٿي.ٻوٽن جي سيلن ۾ مائڪرو ٽيوبولس ڪيترائي ڪردار ادا ڪن ٿا، جن ۾ سيل جي شڪل، سيل ڊويزن، ۽ انٽرا سيلولر ٽرانسپورٽ3,4 شامل آهن.ٻوٽن جي سيلن ۾ انٽرفيس پلازما جھلي جي هيٺان مائڪرو ٽيوبولس شامل هوندا آهن، ۽ اهي نام نهاد ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس سيليولوز سنٿيس ڪمپليڪس 4,5 جي ضابطي ذريعي سيلولوز مائڪروفائبرلز جي تنظيم کي ڪنٽرول ڪندا آهن.روٽ ايپيڊرمل سيلز جا Cortical microtubules، روٽ ٽپ جي تيزيءَ سان ڊگھي ٿيڻ واري علائقي ۾ موجود هوندا آهن، بعد ۾ واقع هوندا آهن، ۽ سيلولوز مائڪرو فائيبر انهن مائڪروٽيوبولس جي پيروي ڪندا آهن ۽ سيل جي توسيع جي هدايت کي محدود ڪندا آهن، ان ڪري anisotropic cell elongation کي فروغ ڏيندا آهن.تنهن ڪري، microtubule فنڪشن ويجهي ٻوٽي جي مورفولوجي سان لاڳاپيل آهي.جين انڪوڊنگ ٽيوبولين ۾ امينو اسيد متبادل سبب Cortical microtubule arrays ۽ Arabidopsis 6,7 ۾ کاٻي يا ساڄي طرف واري واڌ جو سبب بڻجن ٿا.اهڙي طرح، مائڪروٽيوبول سان لاڳاپيل پروٽينن ۾ ميوٽيشنز جيڪي مائڪروٽيوبول جي متحرڪ کي منظم ڪن ٿا، پڻ بگڙيل جڙي جي واڌ کي وڌائي سگھي ٿو 8,9,10,11,12,13.ان کان علاوه، مائڪروٽيوبول کي خراب ڪندڙ جڙي ٻوٽي جي دوائن سان علاج، جهڙوڪ ڊسوپيرامائيڊ، جنهن کي پريتيلاچلور پڻ چيو ويندو آهي، پڻ کاٻي پاسي واري ٿلهي جڙي جي واڌ جو سبب بڻجندي آهي14.اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته ٻوٽن جي واڌ جي هدايت کي طئي ڪرڻ لاءِ مائڪروٽيوبول فنڪشن جو صحيح ضابطو اهم آهي.
مختلف قسم جا microtubule inhibitors دريافت ڪيا ويا آهن، ۽ انهن دوائن cytoskeletal تحقيق سان گڏوگڏ زراعت ۽ دوائن ۾ اهم ڪردار ادا ڪيو آهي.خاص طور تي، oryzalin، dinitroaniline مرکبات، disopyramide، benzamide سان لاڳاپيل مرکبات، ۽ انهن جا اينالاگ مائڪروٽيوبول جي ڪم کي روڪي سگهن ٿا ۽ اهڙي طرح ٻوٽن جي واڌ کي روڪيندا آهن.تنهن ڪري، اهي وڏي پيماني تي herbicides طور استعمال ٿيندا آهن.تنهن هوندي به، ڇاڪاڻ ته مائڪروٽيوبولس ٻوٽن ۽ جانورن جي سيلن جو هڪ اهم حصو آهن، اڪثر مائڪروٽيوبول انبائيٽرز ٻنهي سيل جي قسمن لاء سائٽوٽوڪسڪ آهن.تنهن ڪري، انهن جي سڃاڻپ جي استعمال جي باوجود جڙي ٻوٽي جي طور تي، هڪ محدود تعداد ۾ antimicrotubule ايجنٽ عملي مقصدن لاء استعمال ڪيا ويا آهن.
Streptomyces خاندان جي Streptomyces جي هڪ جينس آهي، جنهن ۾ ايروبڪ، گرام-پازيٽيو، فيلامينٽس بيڪٽيريا شامل آهن ۽ وڏي پيماني تي ثانوي ميٽابولائٽس جي وسيع رينج پيدا ڪرڻ جي صلاحيت لاء مشهور آهي.تنهن ڪري، ان کي نئين حياتياتي فعال قدرتي شين جي سڀ کان اهم ذريعن مان هڪ سمجهيو ويندو آهي.موجوده مطالعي ۾، اسان coumamonamide نالي هڪ نئون مرڪب دريافت ڪيو، جيڪو Streptomyces werraensis MK493-CF1 ۽ S. werraensis ISP 5486 کان ڌار ڪيو ويو. اسپيڪٽرل تجزيي ۽ مڪمل اسپيڪٽرل تجزيي کي استعمال ڪندي، coumamonamide جي ساخت جي خصوصيت ڪئي وئي ۽ ان جي منفرد اين-ايڪسڪسڪس ڪليڪٽرن کي. طئي ڪيو ويو.synthesis.Ursmonic acid، ursmonoamide ۽ ان جي نڪتن جو هڪ مصنوعي وچولي، مشهور ماڊل ٻوٽي Arabidopsis thaliana جي واڌ ۽ اڀرڻ کي روڪڻ لاءِ مليو.ھڪڙي ساخت جي سرگرمي رشتي جي مطالعي ۾، اسان ڏٺو آھي ته ھڪڙو مرڪب C9 سان تبديل ڪيو ويو آھي ursonic acid ۾، جنھن کي nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND) سڏيو ويندو آھي، خاص طور تي ترقي ۽ جراثيم تي روڪڻ واري اثر کي وڌائيندو آھي.خاص طور تي، نئين دريافت ڪيل ٻوٽي جي واڌ جي روڪٿام پڻ تمباکو ۽ جگر جي واڌ کي متاثر ڪيو ۽ بيڪٽيريا يا هيلا سيلز لاء سائٽوٽوڪسڪ نه هو.ان کان علاوه، ڪجهه urmotonic acid derivatives هڪ بگڙيل روٽ فينوٽائپ کي جنم ڏين ٿا، ان جو مطلب آهي ته اهي نڪتل سڌي يا اڻ سڌي طرح مائڪروٽيوبولس کي متاثر ڪن ٿا.هن خيال سان مطابقت رکندڙ، اسان جي مائيڪرو ٽيوبلز جا مشاهدا جيڪي يا ته اميونهسٽو ڪيميڪل يا فلورسنٽ پروٽين سان ليبل ٿيل آهن، ظاهر ڪن ٿا ته KAND علاج مائڪروٽيوبولس کي ڊيپوليمرائيز ڪري ٿو.ان کان سواء، kumamotonic acid derivatives سان علاج ڪيو ويو actin microfilaments.اهڙيء طرح، اسان دريافت ڪيو آهي هڪ نئين ٻوٽي جي واڌ جي روڪٿام جنهن جي عمل جو هڪ منفرد ميڪانيزم شامل آهي cytoskeleton جي تباهي.
Strain MK493-CF1 شيناگاوا-ڪو، ٽوڪيو ۾ مٽي کان ڌار ڪيو ويو.Strain MK493-CF1 ٺھيل چڱي برانچ واري اسٽرومل مائيسيليم.16S ribosomal RNA جين (1422 bp) جو جزوي تسلسل طئي ڪيو ويو.هي strain S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typical strain, 99.93%).هن نتيجي جي بنياد تي، اهو طئي ڪيو ويو ته هي دٻاء ويجهڙائي سان لاڳاپيل هئي S. werraensis جي قسم جي دٻاء سان.تنهن ڪري، اسان عارضي طور تي هن قسم جو نالو S. werraensis MK493-CF1 رکيو.S. werraensis ISP 5486T پڻ ساڳيون حياتياتي مرکبات پيدا ڪري ٿو.جيئن ته هن microorganism کان قدرتي پيداوار حاصل ڪرڻ لاء ٿورو ابتدائي تحقيق ڪيو ويو، وڌيڪ ڪيميائي تحقيق ڪئي وئي.S. werraensis MK493-CF1 جي پوکڻ کان پوءِ بارلي ميڊيم تي سولڊ اسٽيٽ فرمينٽيشن ذريعي 30°C تي 14 ڏينهن تائين، وچولي کي 50٪ EtOH سان ڪڍيو ويو.60 ml نموني کي خشڪ ڪيو ويو ته 59.5 ملي گرام خام ڪڍڻ لاء.N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1، نالي coumamonamide، 36.0 mg) ڏيڻ لاءِ خام نڪتل ريورس فيز HPLC جي تابع ڪيو ويو.1 جي ڪل رقم تقريبن 60٪ خام ڪڍڻ جو آهي.تنهن ڪري، اسان تفصيل سان مطالعو ڪرڻ جو فيصلو ڪيو kumamotoamide 1 جي ملڪيت.
Coumamonamide 1 ھڪڙو سفيد امورفس پائوڊر آھي ۽ اعلي ريزوليوشن ماس اسپيڪٽروميٽري (HRESIMS) تصديق ڪري ٿو C6H8N2O2 (تصوير 1).هن مرڪب جو C2- متبادل پائرول ٽڪرو δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR اسپيڪٽرم ۾: 4.5 Hz ، H-5) ۽ δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6)، ۽ 13C NMR اسپيڪٽرم ڏيکاري ٿو چار sp2 ڪاربان ايٽم جي موجودگي.C2 پوزيشن تي امائيڊ گروپ جي موجودگي جو جائزو ورتو ويو HMBC لاڳاپو C-3 پروٽون کان δC 161.1 تي امائيڊ ڪاربونيل ڪاربن تائين.ان کان علاوه، 1 H ۽ 13 C NMR چوٽي δH 4.10 (3H, S) ۽ δC 68.3 تي انوڪيول ۾ N-methoxy گروپن جي موجودگي کي ظاهر ڪن ٿا.جيتوڻيڪ methoxy گروپ جي صحيح پوزيشن اڃا تائين spectroscopic تجزيي جي استعمال سان طئي نه ڪئي وئي هئي جيئن ته بهتر فرق spectroscopy ۽ ائٽمي اوور هاؤزر مخفف (NOEDF)، N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide پهريون اميدوار مرڪب بڻجي ويو.
1 جي صحيح ڍانچي کي طئي ڪرڻ لاء، مجموعي جوڙجڪ ڪئي وئي (Fig. 2a).تجارتي طور تي موجود 2-aminopyridine 2 جو علاج m-CPBA سان ڪيو ويو جنهن جي نتيجي ۾ N-oxide 3 مقداري پيداوار ۾ ملي ٿي.2 جي 2-aminoazidation کان پوءِ، Abramovich پاران بيان ڪيل cyclocondensation رد عمل 90°C تي بينزين ۾ ڪيو ويو ته جيئن مطلوبه 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 گرام ۾ حاصل ٿئي.رفتار 60٪ (ٻن مرحلن).15,16.4 جي ميٿيليشن ۽ هائيڊولائيزيشن پوءِ 1-ميٿوڪسي-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (اصطلاح “cumotonic acid”, 6) ڏني وئي سٺي پيداوار ۾ (70٪، ٻه قدم).آخرڪار، تيزابي امونيا استعمال ڪندي ايسڊ ڪلورائڊ انٽرميڊيٽ 6 ذريعي 98 سيڪڙو پيداوار ۾ Kumamoto amide 1 ڏني.ٺهيل 1 جي سڀني اسپيڪٽرل ڊيٽا الڳ ٿيل 1 سان ملندڙ جلندڙ هئا، تنهنڪري 1 جي جوڙجڪ طئي ڪئي وئي هئي؛
urbenamide ۽ urbenic امل جي حياتياتي سرگرمي جي جنرل synthesis ۽ تجزيو.(a) Kumamoto amide جي مجموعي جوڙجڪ.(b) ست ڏينهن پراڻا جهنگلي قسم جي Arabidopsis Columbia (Col) ٻج مورشيج ۽ اسڪوگ (MS) پليٽن تي پوکيا ويا جن ۾ coumamonamide 6 يا coumamonamide 1 ڏيکاريل ڪنسنٽريشن تي.اسڪيل بار = 1 سينٽ.
پهرين، اسان urbenamide جي حياتياتي سرگرمين جو جائزو ورتو ۽ ان جي وچولي ٻوٽن جي ترقي کي ماڊل ڪرڻ جي صلاحيت لاء.اسان هن ميڊيم تي ursmonamide 1 يا ursmonic acid 6 جي MS agar ميڊيم ۽ ڪلچر ٿيل Arabidopsis thaliana seedlings ۾ شامل ڪيو.انهن اڀياس ڏيکاريا ته 6 جي اعلي ڪنسنٽريشن (500 μM) روٽ جي واڌ کي روڪيو (Fig. 2b).اڳيون، اسان 6 جي N1 پوزيشن کي متبادل ڪندي مختلف نڪتل پيدا ڪيا ۽ انھن تي ڍانچي-سرگرميءَ واري رشتي جي مطالعي کي انجام ڏنو (اينالاگ سنٿيسس جي عمل کي سپورٽنگ انفارميشن (SI) ۾ بيان ڪيو ويو آھي).Arabidopsis ٻج 50 μM ursonic acid derivatives تي مشتمل وچولي تي پوکيا ويا، ۽ روٽ جي ڊيگهه ماپ ڪئي وئي.جيئن تصوير تي ڏيکاريل آهي.جيئن ته شڪل 3a، b، ۽ S1 ۾ ڏيکاريل آهي، coumamo acids وٽ مختلف ڊگھائيون آھن لڪير واري الڪوڪسي زنجيرن (9، 10، 11، 12، ۽ 13) يا وڏي الڪوڪسي زنجيرن (15، 16، ۽ 17) N1 پوزيشن تي.derivatives ڏيکاريا ويا اهم inhibition روٽ جي ترقي.ان کان علاوه، اسان اهو مليو ته 200 μM 10، 11، يا 17 منع ٿيل جراثيم جي ايپليڪيشن (Figs. 3c ۽ S2).
Kumamoto amide ۽ لاڳاپيل مرکبات جي ساخت-سرگرميءَ جي رشتي جو مطالعو.(a) analogues جي جوڙجڪ ۽ جوڙجڪ اسڪيم.(b) 50 μM coumamonamide derivatives سان گڏ يا ان کان سواءِ MS ميڊيم تي پوکيل 7-ڏينهن پراڻي ٻج جي روٽ ڊگھائي جي مقدار.Asterisks ظاهر ڪن ٿا اهم فرق شام علاج سان (t test، p< 0.05).n >18. ڊيٽا ڏيکاريا ويا آهن مطلب ± SD.nt جو مطلب آهي "ٽيسٽ نه ڪيو ويو" ڇاڪاڻ ته 50 سيڪڙو کان وڌيڪ ٻج نه اڀريا.(c) 200 μM coumamonamide ۽ لاڳاپيل مرکبات سان گڏ يا بغير MS ميڊيم ۾ 7 ڏينهن تائين علاج ٿيل ٻج جي ڄمڻ جي شرح جو مقدار.Asterisks شام علاج سان اهم اختلاف ظاهر ڪن ٿا (چي-اسڪوائر ٽيسٽ).ن = 96.
دلچسپ ڳالهه اها آهي ته الڪائل سائڊ زنجيرن جو اضافو C9 کان وڌيڪ عرصي کان روڪڻ واري سرگرمي کي گهٽائي ٿو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته ڪوماموٽوڪ اسيد سان لاڳاپيل مرکبات کي انهن جي حياتياتي سرگرمي کي ظاهر ڪرڻ لاء هڪ خاص سائيز جي پاسي واري زنجير جي ضرورت آهي.
ڇاڪاڻ ته ساخت جي سرگرمي جي رشتي جي تجزيي ڏيکاري ٿي ته C9 کي ursonic acid ۾ تبديل ڪيو ويو ۽ ursonic acid جو nonyloxy derivative (هاڻي کان پوء KAND 11 جو حوالو ڏنو ويو) سڀ کان وڌيڪ اثرائتي ٻوٽي جي واڌ جي روڪٿام هئي، اسان KAND 11 جي وڌيڪ تفصيلي خاصيت ڪئي. Arabidopsis جو علاج. 50 μM KAND 11 سان لڳ ڀڳ مڪمل طور تي اڀرڻ کي روڪيو ويو، جڏهن ته KAND 11 جي گهٽ ڪنسنٽريشن (40, 30, 20, يا 10 μM) روٽ جي واڌ کي ڊوز تي منحصر انداز ۾ روڪيو (تصوير 4a, b).جانچڻ لاءِ ته ڇا KAND 11 روٽ ميريسٽم جي قابليت کي متاثر ڪري ٿو، اسان جانچيو روٽ ميريسٽمس کي پروپڊيم آئيوڊائڊ (PI) سان داغدار ۽ ماپيل ميريسٽم ايريا سائيز.25 μM KAND-11 تي پوکيل ٻج جي ميريسٽم جي ماپ 151.1 ± 32.5 μm هئي، جڏهن ته DMSO تي مشتمل ڪنٽرول ميڊيم تي پوکيل ٻج جي ميرسٽم جي ماپ 264.7 ± 30.8 μc (Figdm) ، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته KAND-11 سيلولر سرگرمي کي بحال ڪري ٿو.پکيڙڻ.روٽ meristem.انهي سان گڏ، KAND 11 علاج سيل ڊويزن مارڪر جي مقدار کي گھٽائي ڇڏيو CDKB2؛ 1p:: CDKB2؛ 1-GUS سگنل روٽ ميريسٽم ۾ (Fig. 4e) 17.انهن نتيجن مان ظاهر ٿئي ٿو ته KAND 11 سيل جي واڌاري جي سرگرمي کي گهٽائڻ سان روٽ جي واڌ کي روڪي ٿو.
ترقي تي urbenonic acid derivatives (urbenyloxy derivatives) جي روڪڻ واري اثر جو تجزيو.(a) 7-ڏينهن پراڻي جهنگلي قسم جا Col seedlings MS پليٽن تي پوکيا ويا آهن جن ۾ KAND 11 جي ڏيکاريل ڪنسنٽريشن. اسڪيل بار = 1 سينٽي.(b) روٽ ڊگھائي جو مقدار.اکر ظاهر ڪن ٿا اهم اختلافن (ٽڪي HSD ٽيسٽ، ص< 0.05).n >16. ڊيٽا ڏيکاريا ويا آهن مطلب ± SD.(c) 25 μM ڪانڊ 11 سان يا ان کان سواءِ MS پليٽن تي پوکيل پروپيڊيم آئوڊائڊ اسٽينڊ ٿيل جهنگلي قسم جي ڪال روٽ جي ڪنفوڪل مائڪرو اسڪوپي. اڇي بریکٹ روٽ ميرسٽم کي ظاهر ڪن ٿا.اسڪيل بار = 100 µm.(d) روٽ meristem سائيز جي مقدار (n = 10 کان 11).شمارياتي اختلافن کي ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو (p< 0.05).بار اوسط ميريسٽم سائيز جي نمائندگي ڪن ٿا.(e) Differential interference Contrast (DIC) هڪ روٽ ميريسٽم جي مائڪرو اسڪوپي جنهن ۾ CDKB2 تعمير ٿيل آهي؛1 پرو: CDKB2؛1-GUS 25 µM KAND assay سان يا ان کان سواءِ MS پليٽن تي پوکيل 5 ڏينهن جي پراڻي ٻج تي داغ ۽ داغ.
KAND 11 جي phytotoxicity کي وڌيڪ آزمايو ويو هڪ ٻيو dicotyledonous plant، تمباکو (Nicotiana tabacum)، ۽ هڪ وڏي زميني ٻوٽي جي ماڊل آرگنزم، ليورورٽ (مارچنٽيا پوليمورفا).جيئن ته Arabidopsis جي صورت ۾، تمباکو SR-1 ٻج وچولي سطح تي پوکيا ويا جن ۾ 25 μM کنڊ 11 ننڍا جڙ پيدا ڪيا ويا (تصوير 5a).اضافي طور تي، 48 مان 40 ٻج پليٽن تي اڀريا جن ۾ 200 μM ڪانڊ 11 شامل آهن، جڏهن ته سڀئي 48 ٻج ٺٺوليون ٿيل ميڊيا تي اڀريا، ظاهر ڪن ٿا ته کنڊ جي اعلي ڪنسنٽريشن اهم هئي (p.< 0.05؛chi test -square) تمباکو جي اڀرڻ کي روڪيو.(تصوير 5b).ان کان علاوه، KAND 11 جو ڪنسنٽريشن جيڪو جگر ۾ بيڪٽيريا جي واڌ کي روڪي ٿو، عربيڊوپسس (تصوير 5c) ۾ مؤثر ڪنسنٽريشن وانگر هو.انهن نتيجن مان ظاهر ٿئي ٿو ته KAND 11 مختلف ٻوٽن جي واڌ کي روڪي سگهي ٿو.ان کان پوءِ اسان ٻين جاندارن ۾ بيئر مونوامائيڊ سان لاڳاپيل مرکبات جي ممڪن سائٽوٽوڪسيسي جي تحقيق ڪئي، يعني انساني HeLa سيلز ۽ Escherichia coli strain DH5α، بالترتيب اعليٰ جانورن ۽ بيڪٽيريل سيلز جي نمائندن جي طور تي.سيل جي واڌ ويجهه جي هڪ سيريز ۾، اسان ڏٺو ته ڪومامونامائيڊ 1، ڪوماموناميڊڪ ايسڊ 6، ۽ ڪينڊ 11 100 μM (Fig. 5d،e) جي ڪنسنٽريشن تي HeLa يا E. coli سيلز جي واڌ کي متاثر نه ڪيو.
KAND 11 جي واڌ جي روڪٿام غير عربيڊوپسس جاندارن ۾.(a) ٻه هفتا پراڻي جهنگلي قسم جي SR-1 تمباکو جا ٻج عمودي پوزيشن تي پوکيا ويا MS پليٽن تي جن ۾ 25 μM کنڊ 11 شامل هئا. MS پليٽون جن ۾ 200 μM ڪانڊ 11 شامل آهن. (c) ٻه هفتا پراڻا جهنگلي قسم جي ٽاڪ-1 ليور واٽ بڊ جيڪي گيمبرگ B5 پليٽن تي وڌا ويا آهن جن ۾ ڪانڊ 11 جي نشاندهي ڪيل ڪنسنٽريشن سان. لال تير انهن spores کي ظاهر ڪن ٿا جيڪي ٻن هفتن جي انڪيوبيشن ۾ وڌڻ بند ٿي ويا آهن عرصو(d) HeLa سيلز جي سيل پرولريشن جو جائزو.قابل عمل سيلن جو تعداد ماپ ڪيو ويو مقرر وقت جي وقفن تي سيل ڳڻپ کٽ 8 (Dojindo) استعمال ڪندي.ڪنٽرول جي طور تي، هيلا سيلز کي 5 μg/ml actinomycin D (Act D) سان علاج ڪيو ويو، جيڪو RNA پوليميرس ٽرانسپشن کي روڪي ٿو ۽ سيل جي موت جو سبب بڻجندو آهي.تجزيا ٽنهي صورتن ۾ ڪيا ويا.(e) E. coli cell proliferation assay.اي ڪولي جي واڌ جو تجزيو ڪيو ويو OD600 ماپڻ سان.ضابطي جي طور تي، سيلز کي 50 μg/ml ampicillin (Amp) سان علاج ڪيو ويو، جيڪو بيڪٽيريا جي سيل وال جي جوڙجڪ کي روڪي ٿو.تجزيا ٽنهي صورتن ۾ ڪيا ويا.
يورامائيڊ سان لاڳاپيل مرکبات جي ڪري سائٽوٽوڪسائيٽي جي عمل جي ميکانيزم کي سمجھڻ لاءِ، اسان urbenic ائسڊ ڊيريويٽوز کي معتدل روڪڻ واري اثرات سان ٻيهر تجزيو ڪيو.جيئن تصوير تي ڏيکاريل آهي.جيئن ته شڪل 2b، 6a ۾ ڏيکاريل آهي، اگار جي پليٽن تي پوکيل ٻج جن ۾ urmotonic acid 6 جي وڏي مقدار (200 μM) هوندي آهي، اهي ننڍا ۽ کاٻي طرف مڙيل جڙ (θ = – 23.7 ± 6.1) پيدا ڪندا آهن، جڏهن ته ڪنٽرول وچولي تي پوکيل ٻج، ٻج لڳ ڀڳ سڌا جڙ پيدا ڪيا (θ = – 3.8 ± 7.1).هي خصوصيت ترڪيب جي واڌ جي نتيجي ۾ معلوم ٿئي ٿو ته cortical microtubules جي dysfunction 14,18.هن ڳولها سان مطابقت، مائڪروٽيوبول کي غير مستحڪم ڪرڻ واريون دوائون ڊسپوپيرامائيڊ ۽ اوريزالين اسان جي ترقي جي حالتن هيٺ ساڳي روٽ ٽائلنگ کي وڌايو (تصوير 2b، 6a).ساڳئي وقت، اسان urmotonic acid derivatives کي آزمايو ۽ انهن مان ڪيترن کي چونڊيو، جيڪي ڪجهه خاص ڪنسنٽريشن تي، موڙيندڙ جڙ جي واڌ کي وڌايو.مرڪب 8، 9، ۽ 15 ترتيب سان 75 μM، 50 μM، ۽ 40 μM تي روٽ جي واڌ جي هدايت کي تبديل ڪيو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته اهي مرکبات مؤثر طور تي مائڪروٽيوبولس کي غير مستحڪم ڪري سگهن ٿا (تصوير 2b، 6a).اسان سڀ کان وڌيڪ طاقتور ursolic acid derivative، KAND 11، گهٽ ڪنسنٽريشن (15 µM) تي پڻ آزمايو ۽ ڏٺائين ته KAND 11 جي ايپليڪيشن روٽ جي واڌ کي روڪيو ۽ اهو روٽ جي واڌ جي هدايت غير برابر هئي، جيتوڻيڪ اهي کاٻي طرف سلپ ڪرڻ لڳا ( شڪل C3)..ڇاڪاڻ ته مائيڪرو ٽيوبول کي غير مستحڪم ڪرڻ واري دوائن جو وڌيڪ مقدار ڪڏهن ڪڏهن ٻوٽن جي واڌ کي روڪي ٿو بجاءِ روٽ ٽائلنگ جو سبب، اسان ان کان پوءِ ان امڪان جو اندازو لڳايو ته KAND 11 روٽ ايپيڊرمل سيلز ۾ ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس جو مشاهدو ڪندي مائڪروٽيوبولس کي متاثر ڪري ٿو.25 μM KAND 11 سان علاج ٿيل ٻج جي جڙڙن جي ايپيڊرمل سيلز ۾ اينٽي β-ٽيوبولين اينٽي باڊيز استعمال ڪندي Immunohistochemistry ڏيکاري ٿي ته لڳ ڀڳ سڀني ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس جي غائب ٿيڻ واري علائقي ۾ ايپيڊرمل سيلز ۾ (تصوير 6b).اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته ڪوماموٽونڪ ايسڊ ۽ ان جا نڪتل مائڪروٽيوبولس تي سڌي يا اڻ سڌي طرح ڪم ڪن ٿا انهن کي ٽوڙڻ لاءِ ۽ اهي مرکبات ناول مائڪروٽيوبول انبائيٽرز آهن.
Ursonic acid ۽ ان جا نڪتل Arabidopsis thaliana ۾ Cortical microtubules کي تبديل ڪن ٿا.(a) روٽ جي جھلڻ واري زاويه ماپ ڪئي وئي مختلف urmotonic acid derivatives جي موجودگي ۾ اشارو ڪيل ڪنسنٽريشن تي.ٻن مرکبن جا اثر جيڪي مائڪروٽيوبولس کي روڪڻ لاءِ سڃاتل آهن: ڊسوپيرامائيڊ ۽ اوريزالين پڻ تجزيو ڪيو ويو.انسيت ڏيکاري ٿو معياري روٽ جي ترقي جي زاوي کي ماپڻ لاء استعمال ڪيو ويو.Asterisks ظاهر ڪن ٿا اهم فرق شام علاج سان (t test، p< 0.05).n >19. اسڪيل بار = 1 سينٽي ميٽر.(b) ڊگھائي واري علائقي ۾ ايپيڊرمل سيلز ۾ Cortical microtubules.Microtubules in Wild-type Arabidopsis Col Rots MS پليٽن تي 25 μM KAND 11 سان گڏ يا ان کان سواءِ وڌيا ويا آهن β-tubulin پرائمري اينٽي باڊيز ۽ Alexa Fluor-conjugated ثانوي اينٽي باڊيز استعمال ڪندي اميونوهسٽو ڪيميڪل اسٽيننگ ذريعي.اسڪيل بار = 10 µm.(c) روٽ meristem ۾ microtubules جي Mitotic ساخت.Microtubules immunohistochemical staining استعمال ڪندي تصور ڪيا ويا.Mitotic اڏاوتون، بشمول prophase zones، spindles، ۽ phragmoplasts، confocal تصويرن مان شمار ڪيا ويا.تير mitotic microtubule ساخت جي نشاندهي ڪن ٿا.Asterisks ظاهر ڪن ٿا اهم فرق شام علاج سان (t test، p< 0.05).n >9. اسڪيل بار = 50 µm.
جيتوڻيڪ Ursa وٽ مائڪروٽيوبول جي ڪم کي خراب ڪرڻ جي صلاحيت آهي، ان جي عمل جو ميکانيزم عام مائڪروٽيوبول ڊيپوليمرائيزنگ ايجنٽ کان مختلف ٿيڻ جي اميد رکي ٿو.مثال طور، مائيڪرو ٽيوبول ڊيپوليمرائيزنگ ايجنٽن جي وڌيڪ مقدار جهڙوڪ ڊسوپيرامائيڊ ۽ اوريزيلين ايپيڊرمل سيلز جي انيسوٽروپڪ توسيع کي متاثر ڪن ٿا، جڏهن ته KAND 11 نه.ان کان علاوه، KAND 11 ۽ disopyramide جي گڏيل اپليڪشن جي نتيجي ۾ هڪ گڏيل disopyramide-حوصلہ افزائي روٽ جي واڌ جي رد عمل ۽ KAND 11-حوصلہ افزائي ترقي جي نمائش جو مشاهدو ڪيو ويو (تصوير S4).اسان KAND 11 کي hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) ميوٽيٽ جي جواب جو پڻ تجزيو ڪيو. phs1-1 وٽ هڪ غير معياري ٽيوبولين ڪائناس پوائنٽ ميوٽيشن آهي ۽ جڏهن ڊسپوپيرامائيڊ 9,20 سان علاج ڪيو وڃي ٿو ته ننڍا جڙ پيدا ڪري ٿو.phs1-1 ميوٽينٽ ٻج اگار ميڊيم تي پوکيا ويندا آهن جن ۾ ڪانڊ 11 شامل هوندا آهن انهن جا ننڍڙا ٻوٽا ساڳيا هوندا هئا جيڪي ڊسپوپيرامڊ (fig. S5) تي پوکيا ويندا هئا.
ان کان علاوه، اسان KAND 11 سان علاج ڪيل ٻج جي روٽ ميريسٽم ۾ mitotic microtubule ڍانچي، جهڙوڪ prophase zones، spindles ۽ phragmoplasts جو مشاهدو ڪيو. CDKB2؛ 1p:: CDKB2؛ 1-GUS لاءِ مشاهدن سان مطابقت، هڪ اهم گهٽتائي mitotic microtubules جو تعداد ڏٺو ويو (Fig. 6c).
KAND 11 جي cytotoxicity کي نمايان ڪرڻ لاءِ ذيلي سيلولر ريزوليوشن تي، اسان تمباکو BY-2 معطلي سيلز کي KAND 11 سان علاج ڪيو ۽ انهن جي ردعمل جو مشاهدو ڪيو.اسان پهريون ڀيرو KAND 11 کي BY-2 سيلز ۾ شامل ڪيو جيڪو TagRFP-TUA6 جو اظهار ڪري ٿو، جيڪو فلورسنٽ طور مائڪروٽيوبولس کي ليبل ڪري ٿو، ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس تي KAND 11 جي اثر جو اندازو لڳائڻ لاءِ.Cortical microtubule density جو جائزو ورتو ويو تصويري تجزيو استعمال ڪندي، جنهن ۾ cytoskeletal پکسلز جي فيصد مقدار کي cytoplasmic پکسلز جي وچ ۾ وڌايو ويو.امتحان جا نتيجا ڏيکاريا ويا ته 50 μM يا 100 μM کنڊ 11 سان 1 ڪلاڪ لاءِ علاج ڪرڻ کان پوءِ، کثافت بالترتيب 0.94 ± 0.74٪ يا 0.23 ± 0.28٪ تائين گهٽجي وئي، جڏهن ته DMSO سان علاج ڪيل سيلن جي کثافت، مقدار 1.4±1 ± 1.6. % (Fig. 7a).اهي نتيجا Arabidopsis ۾ ڪيل مشاهدي سان هڪجهڙائي رکن ٿا ته KAND 11 جو علاج cortical microtubules (Fig. 6b) جي depolymerization indus ڪري ٿو.اسان BY-2 لائن کي پڻ جانچيو GFP-ABD-ليبل ٿيل ايٽين فلامينس سان علاج کان پوءِ KAND 11 جي ساڳئي ڪنسنٽريشن سان ۽ مشاهدو ڪيو ته KAND 11 علاج ايڪٽين فلامينن کي خراب ڪري ٿو.50 μM يا 100 μM ڪانڊ 11 سان 1 ايڇ لاءِ علاج خاص طور تي ايڪٽين فليمينٽ جي کثافت کي 1.20 ± 0.62٪ يا 0.61 ± 0.26٪ تائين گھٽائي ٿو، جڏهن ته DMSO-علاج ٿيل سيلز ۾ کثافت 1.69٪ F.5 ± 0.5 ± 0.26٪ هئي.7b).اهي نتيجا propyzamide جي اثرن جي ابتڙ آهن، جيڪو اثر نه ٿو ڪري actin filaments، ۽ latrunculin B، هڪ actin depolymerizer جيڪو microtubules کي متاثر نٿو ڪري (SI Figure S6).ان کان علاوه، coumamonamide 1، coumamonamide acid 6، يا KAND 11 سان علاج هيلا سيلز (SI Figure S7) ۾ مائڪروٽيوبولس کي متاثر نه ڪيو.اهڙيءَ طرح، KAND 11 جي عمل جو ميکانيزم مڃيو وڃي ٿو ته سڃاتل cytoskeleton disruptors کان مختلف آهي.ان کان علاوه، KAND 11 سان علاج ڪيل BY-2 سيلز جي اسان جي خوردبيني مشاهدي ۾ KAND 11 جي علاج دوران سيلز جي موت جي شروعات کي ظاهر ڪيو ويو ۽ ظاهر ڪيو ويو ته Evans blue-stained dead cells جو تناسب KAND 11 جي علاج جي 30 منٽن کان پوءِ به گهڻو نه وڌيو، جڏهن ته. 50 μM يا 100 μM کنڊ سان علاج جي 90 منٽن کان پوء، مئل سيلن جو تعداد وڌي ويو 43.7٪ يا 80.1٪، ترتيب سان (تصوير 7c).گڏ ڪيل، اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته ناول ursolic acid derivative KAND 11 هڪ پلانٽ-مخصوص cytoskeletal inhibitor آهي جيڪو عمل جي اڳئين نامعلوم ميڪانيزم سان.
KAND متاثر ڪري ٿو cortical microtubules، actin filaments، ۽ تمباکو BY-2 سيلز جي قابل عمل.(a) TagRFP-TUA6 جي موجودگي ۾ BY-2 سيلز ۾ ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس جو تصور.BY-2 سيلز KAND 11 (50 μM يا 100 μM) يا DMSO سان علاج ڪيا ويا ڪنفوڪل مائڪروسکوپي ذريعي.Cortical microtubule density 25 آزاد سيلز جي micrographs مان ڳڻيو ويو.اکر ظاهر ڪن ٿا اهم اختلافن (ٽڪي HSD ٽيسٽ، ص< 0.05).اسڪيل بار = 10 µm.(b) BY-2 سيلز ۾ Cortical actin filaments نظريا GFP-ABD2 جي موجودگي ۾.BY-2 سيلز KAND 11 (50 μM يا 100 μM) يا DMSO سان علاج ڪيا ويا ڪنفوڪل مائڪروسکوپي ذريعي.cortical actin filaments جي کثافت 25 آزاد خاني جي micrographs مان حساب ڪيو ويو.اکر ظاهر ڪن ٿا اهم اختلافن (ٽڪي HSD ٽيسٽ، ص< 0.05).اسڪيل بار = 10 µm.(c) Evans blue staining پاران مئل BY-2 سيلز جو مشاهدو.KAND 11 (50 μM يا 100 μM) يا DMSO سان علاج ٿيل BY-2 سيلز روشن فيلڊ مائڪرو اسڪوپي ذريعي جانچيا ويا.ن = 3.اسڪيل بار = 100 µm.
نئين قدرتي شين جي دريافت ۽ ايپليڪيشن انساني زندگي جي مختلف شعبن ۾ اهم ترقي ڪئي آهي، بشمول دوا ۽ زراعت.قدرتي وسيلن مان مفيد مرکبات حاصل ڪرڻ لاءِ تاريخي تحقيق ڪئي وئي آهي.خاص طور تي، actinomycetes کي nematodes لاء antiparasitic antibiotics طور سڃاتو وڃي ٿو ڇاڪاڻ ته انهن جي مختلف ثانوي ميٽابولائٽس جهڙوڪ avermectin، ivermectin ۽ bleomycin جو اڳوڻو مرڪب ۽ ان مان نڪتل شيون، جيڪي دوائن ۾ استعمال ٿيندڙ اينٽي ڪينسر ايجنٽ 21,22 طور استعمال ڪيا ويا آهن.اهڙي طرح، هڪ قسم جي جڙي ٻوٽي جي مرڪب کي دريافت ڪيو ويو آهي actinomycetes مان، جن مان ڪجهه اڳ ۾ ئي تجارتي طور تي استعمال ڪيا ويا آهن 1,23.تنهن ڪري، گهربل حياتياتي سرگرمين سان قدرتي شين کي الڳ ڪرڻ لاء actinomycete ميٽابولائٽس جو تجزيو هڪ مؤثر حڪمت عملي سمجهيو ويندو آهي.هن مطالعي ۾، اسان S. werraensis مان هڪ نئون مرڪب، coumamonamide دريافت ڪيو ۽ ان کي ڪاميابي سان گڏ ڪيو.Ursonic acid urbenamide ۽ ان جي نڪتل شين جو هڪ مصنوعي وچولي آهي.اهو خاصيت جي روٽ جي ڪرلنگ جو سبب بڻجي سگهي ٿو، اعتدال پسند کان مضبوط جڙي ٻوٽي جي سرگرمي کي ظاهر ڪري ٿو، ۽ سڌي يا اڻ سڌي طرح ٻوٽي جي مائڪروٽيوبولس کي نقصان پهچائي سگھي ٿو.بهرحال، urmotonic acid جي عمل جو ميڪانيزم موجوده microtubule inhibitors کان مختلف ٿي سگهي ٿو، ڇاڪاڻ ته KAND 11 پڻ ايڪٽين فيلامنٽ کي روڪي ٿو ۽ سيل جي موت جو سبب بڻائيندو آهي، هڪ ريگيوليٽري ميڪانيزم جو مشورو ڏئي ٿو، جنهن جي ذريعي urmotonic acid ۽ ان مان نڪتل cytoskeletal جوڙجڪ جي وسيع رينج تي اثر انداز ڪن ٿا..
urbenonic acid جي وڌيڪ تفصيلي خصوصيت کي urbenonic acid جي عمل جي ميڪانيزم کي بهتر سمجهڻ ۾ مدد ملندي.خاص طور تي، ايندڙ مقصد ursonic ايسڊ جي قابليت جو اندازو لڳائڻ آهي ته جيئن گھٽايل مائڪروٽيوبولس کي پابند ڪرڻ لاءِ اهو طئي ڪيو وڃي ته ڇا ursonic ايسڊ ۽ ان جا نڪتل سڌو سنئون مائڪروٽيوبولس تي عمل ڪن ٿا ۽ انهن کي ڊيپوليمرائيز ڪن ٿا، يا ڇا انهن جي عمل جي نتيجي ۾ مائڪروٽيوبول عدم استحڪام پيدا ٿئي ٿي.ان کان علاوه، ان صورت ۾ جتي مائڪروٽيوبولس سڌو هدف نه هوندا آهن، عمل جي سائيٽ جي نشاندهي ڪرڻ ۽ ٻوٽن جي سيلن تي ursonic ايسڊ جي ماليڪيولر هدفن کي وڌيڪ سمجهڻ ۾ مدد ملندي لاڳاپيل مرکبات جي ملڪيتن کي سمجهڻ ۽ ممڪن طريقن سان جڙي ٻوٽي جي سرگرمي کي بهتر ڪرڻ لاء.اسان جي بايو ايڪٽيٽي جي تحقيق ٻوٽن جي واڌ ويجهه تي ursonic ايسڊ جي منفرد cytotoxic صلاحيت کي ظاهر ڪيو آهي جهڙوڪ Arabidopsis thaliana، تمباکو ۽ ليورورٽ، جڏهن ته E. coli ۽ HeLa سيلز متاثر نه ٿيا.جانورن جي سيلن لاءِ ٿورو يا ڪو زهر نه هجڻ ursonic acid derivatives جو هڪ فائدو آهي جيڪڏهن انهن کي کليل زرعي زمينن ۾ استعمال لاءِ جڙي ٻوٽي جي دوائن طور تيار ڪيو وڃي.درحقيقت، ڇاڪاڻ ته مائڪروٽيوبولس يوڪريوٽس ۾ عام جوڙجڪ آهن، انهن جي ٻوٽن ۾ چونڊيل رڪاوٽ جڙي ٻوٽي جي لاء هڪ اهم ضرورت آهي.مثال طور، propyzamide، هڪ microtubule depolymerizing agent جيڪو سڌو سنئون tubulin سان ڳنڍيندو آهي ۽ پوليمرائيزيشن کي روڪيندو آهي، جانورن جي سيلن ۾ ان جي گهٽ زهر جي ڪري ٻوٽي مار دوا طور استعمال ڪيو ويندو آهي24.disopyramide جي ابتڙ، لاڳاپيل benzamides مختلف ٽارگيٽ خاصيتون آهن.ٻوٽن جي مائڪروٽيوبولس کان علاوه، RH-4032 يا بينزوڪسامائيڊ پڻ جانورن جي سيلن يا oomycetes جي مائڪرو ٽيوبولس کي روڪي ٿو، ۽ زليلامائيڊ کي فنگسائڊ طور استعمال ڪيو ويندو آهي ڇاڪاڻ ته ان جي گھٽ فائيٽوٽوڪسائيٽي 25,26,27 جي ڪري.نوان دريافت ٿيل بيئر ۽ ان جا نڪتل ٻوٽن جي خلاف چونڊ سائٽوٽوڪسيٽي جي نمائش ڪن ٿا، پر اها ڳالهه نوٽ ڪرڻ جي لائق آهي ته وڌيڪ تبديليون انهن جي حدف جي خاصيت کي تبديل ڪري سگهن ٿيون، ممڪن طور تي pathogenic fungi يا oomycetes جي ڪنٽرول لاءِ اضافي نڪتل مهيا ڪري ٿي.
urbenonic acid جي منفرد ملڪيت ۽ ان جا نڪتل جزا ان جي ترقي لاءِ ڪارآمد آهن جيئن ته هيبائڊس ۽ تحقيقي اوزار طور استعمال ڪن ٿا.ٻوٽن جي سيل جي شڪل کي ڪنٽرول ڪرڻ ۾ cytoskeleton جي اهميت وڏي پيماني تي تسليم ٿيل آهي.اڳوڻي اڀياس ڏيکاريا آهن ته ٻوٽن ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبول آرگنائيزيشن جي پيچيده ميڪانيزم کي ترقي ڪئي آهي مائڪروٽيوبول ڊينامڪس کي ڪنٽرول ڪرڻ لاءِ صحيح طريقي سان مورفوگينيسس کي ڪنٽرول ڪرڻ لاءِ.مائڪروٽيوبول سرگرمي جي ضابطي لاءِ ذميوار ماليڪيولن جي وڏي تعداد جي نشاندهي ڪئي وئي آهي، ۽ لاڳاپيل تحقيق اڃا تائين جاري آهي 3,4,28.ٻوٽن جي سيلن ۾ مائڪروٽيوبول جي متحرڪات جي اسان جي موجوده سمجھ ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبول تنظيم جي ميڪانيزم کي مڪمل طور تي وضاحت نٿو ڪري.مثال طور، جيتوڻيڪ ڊسوپيرامائيڊ ۽ اوريزالين ٻنهي مائڪروٽيوبولس کي ڊيپوليمرائيز ڪري سگھن ٿا، ڊسوپيرامائيڊ سخت روٽ مسخ جو سبب بڻجن ٿا جڏهن ته اوريزالين جو نسبتاً نرم اثر آهي.ان کان علاوه، ٽيوبولين ۾ ميوٽيشنز، جيڪي مائڪروٽيوبولز کي مستحڪم ڪن ٿا، پڻ جڙڙن ۾ ڊيڪسٽرو روٽيشن جو سبب بڻجن ٿا، جڏهن ته پيليٽيڪسيل، جيڪو پڻ مائڪروٽيوبول جي متحرڪ کي مستحڪم ڪري ٿو.تنهن ڪري، ursolic اسيد جي ماليڪيول هدفن جي مطالعي ۽ سڃاڻپ ڪرڻ گهرجي ٻوٽن جي ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس جي ضابطي ۾ نئين بصيرت مهيا ڪن.ساڳئي طرح، مستقبل جي مقابلي ۾ ڪيميائي مادا جيڪي مسخ ٿيل واڌ کي وڌائڻ ۾ اثرائتي آهن، جهڙوڪ ڊسوپيرامائيڊ، ۽ گهٽ اثرائتو ڪيميائي، جهڙوڪ oryzalin يا kumamotoric acid، اشارا مهيا ڪندا ته ڪيئن بگڙيل ترقي ٿئي ٿي.
ٻئي طرف، دفاعي سان لاڳاپيل cytoskeletal rearrangements ursonic acid جي cytotoxicity جي وضاحت ڪرڻ لاء هڪ ٻيو امڪان آهي.ٻوٽن جي سيلن ۾ پيٿوجين جو انفيڪشن يا ايليڪٽر جو تعارف ڪڏهن ڪڏهن سائٽوسڪيلٽن جي تباهي ۽ ان کان پوءِ سيل جي موت جو سبب بڻجندو آهي.مثال طور، oomycete-derived cryptoxanthin کي ٻڌايو ويو آهي ته مائيڪرو ٽيوبولس ۽ ايڪٽين فلامينن کي ٽوباڪو سيل جي موت کان اڳ، جيڪو KAND علاج سان ٿئي ٿو 30,31.ursonic acid پاران پيدا ڪيل دفاعي جوابن ۽ سيلولر جوابن جي وچ ۾ هڪجهڙائي اسان کي اهو تصور ڪرڻ جي هدايت ڪئي ته اهي عام سيلولر عمل کي متحرڪ ڪن ٿا، جيتوڻيڪ cryptoxanthin جي ڀيٽ ۾ ursonic acid جو تيز ۽ مضبوط اثر واضح آهي.بهرحال، اڀياس ڏيکاريا آهن ته ايڪٽين فلامينن جي ڀڃڪڙي خود بخود سيل جي موت کي فروغ ڏئي ٿو، جيڪو هميشه مائڪروٽيوبول جي ڀڃڪڙي سان گڏ نه هوندو آهي.ان کان علاوه، اهو ڏسڻ ۾ اچي ٿو ته ڇا يا ته pathogen يا elicitor مسخ ٿيل جڙ جي واڌ جو سبب بڻجن ٿا، جيئن ursonic acid derivatives ڪندا آهن.ان ڪري، ماليڪيولر علم ڳنڍڻ واري دفاعي جوابن ۽ سائٽوسڪليٽن کي هڪ پرڪشش مسئلو آهي جنهن کي حل ڪيو وڃي.ursonic acid سان لاڳاپيل گھٽ ماليڪيولر وزن مرکبات جي موجودگي کي استحصال ڪندي، ۽ گڏوگڏ مختلف طاقتن سان نڪتلن جي حد تائين، اهي اڻڄاتل سيلولر ميڪانيزم کي نشانو بڻائڻ جا موقعا مهيا ڪري سگھن ٿا.
گڏ ڪيو ويو، نئين مرکبات جي دريافت ۽ ايپليڪيشن جيڪي مائڪروٽيوبول جي متحرڪ کي ماڊل ڪن ٿا، طاقتور طريقا مهيا ڪندا ته پيچيده ماليڪيول ميڪانيزم کي حل ڪرڻ لاء ٻوٽن جي سيل جي شڪل جي تعين هيٺ.ان سلسلي ۾، تازو ترقي يافته مرڪب urmotonic ايسڊ، جيڪو مائڪروٽيوبولس ۽ ايڪٽين فلامينس کي متاثر ڪري ٿو ۽ سيل جي موت کي متاثر ڪري ٿو، شايد مائڪروٽيوبول ڪنٽرول ۽ انهن ٻين ميکانيزم جي وچ ۾ رابطي کي سمجهڻ جو موقعو فراهم ڪري سگهي ٿو.اهڙيءَ طرح، urbenonic acid استعمال ڪندي ڪيميائي ۽ حياتياتي تجزيا اسان کي ماليڪيولر ريگيوليٽري ميڪانيزم کي سمجهڻ ۾ مدد ڏين ٿا جيڪي ٻوٽي سائٽوسڪليٽن کي ڪنٽرول ڪن ٿا.
S. werraensis MK493-CF1 کي هڪ 500 mL بيفلڊ Erlenmeyer فلاسڪ ۾ لڳايو جنهن ۾ 110 mL ٻج ميڊيم جنهن ۾ 2% (w/v) galactose، 2% (w/v) ايسنس پيسٽ، 1% (w/v) بيڪٽو ڪمپوزيشن. .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.)، 0.5% (w/v) مکڻ جو عرق (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan)، 0.2% (w/v) (NH4) 2SO4 ۽ 0.2% CaCO3 ديونائي پاڻيءَ ۾.(pH 7.4 sterilization کان اڳ).ٻج ڪلچر کي روٽري شيڪر (180 rpm) تي 27 ڊگري سينٽي گريڊ تي 2 ڏينهن لاءِ سينگ ڪيو ويو.پيداوار جي پوک کي مضبوط رياست خمير ذريعي.ٻج ڪلچر (7 ml) کي 500 ml K-1 فلاسڪ ۾ منتقل ڪيو ويو جنهن ۾ 40 گرام پيداواري ميڊيم شامل آهي جنهن ۾ 15 گرام دٻايل بارلي (MUSO Co., Ltd., Japan) ۽ 25 g deionized water (pH ترتيب نه ڏني وئي آهي. sterilization کان اڳ).).14 ڏينهن تائين اونداهي ۾ 30 درجا سينٽي گريڊ تي خمير ڪيو ويو.خمير جي مواد کي 40 ml / بوتل EtOH ۽ سينٽرفيوجڊ (1500 گ، 4 ° سي، 10 منٽ) سان ڪڍيو ويو.ڪلچر سپرنٽنٽ (60 ml) 10٪ MeOH/EtOAc جي مرکب سان ڪڍيو ويو.نامياتي پرت کي گھٽ دٻاءُ هيٺ تباھ ڪيو ويو ھڪڙو رھائش (59.5 mg) حاصل ڪرڻ لاءِ، جنھن کي HPLC جي تابع ڪيو ويو گريجوئيٽ ايليوشن (0-10 منٽ: 90%) سان ريورس فيز ڪالمن تي (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × ڊگھائي 250 mm) H2O/CH3CN، 10–35 منٽ: 90% H2O/CH3CN کان 70% H2O/CH3CN (گريڊئينٽ)، 35–45 منٽ: 90% H2O/EtOH، 45–155 منٽ: 90% HO2 /EtOH کان 100٪ EtOH (گريڊئينٽ (گريڊئينٽ)، 155-200 منٽ: 100٪ EtOH) 1.5 ml/min جي وهڪري جي شرح تي، ڪومامونامائيڊ (1, 36.0 mg) کي اڇو امورفوس پائوڊر طور الڳ ڪيو ويو.
Kumamotoamide (1)؛1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).)، 4.08 (s، 3H)؛13C-NMR (125 MHz، CDCl3) δ 161.1، 121.0، 119.9، 112.2، 105.0، 68.3؛ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ڳڻپيوڪر قدر: 141.0659، ماپيل قدر: 141.0663، IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1593–157cm.
ڪولمبيا جا ٻج (Col-0) حاصل ڪيا ويا Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) کان تحقيق جي استعمال جي اجازت سان.Col-0 ٻج پروپيگنڊا ڪيا ويا ۽ اسان جي ليبارٽري جي حالتن ۾ برقرار رکيا ويا ۽ جهنگلي قسم جي Arabidopsis نباتات طور استعمال ڪيا ويا.Arabidopsis ٻج مٿاڇري تي جراثيم سان ٺهيل هئا ۽ اڌ-طاقت واري مورشيج ۽ اسڪوگ وچولي ۾ 2٪ sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical)، 0.05٪ (w/v) 2- (4-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) ( Fujifilmical Wako Pure Chemical) ).) ۽ 1.5٪ آگر (فوجي فلم واڪو خالص ڪيميائي)، پي ايڇ 5.7، 23 ° سي تي ۽ مسلسل روشني.phs1-1 ميوٽنٽ جا ٻج T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) پاران مهيا ڪيا ويا.
SR-1 جا ٻج T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) پاران مهيا ڪيا ويا ۽ جهنگلي قسم جي تمباکو جي ٻوٽن طور استعمال ڪيا ويا.تمباکو جي ٻج کي جراثيم کان پاڪ ڪيو ويو ۽ جراثيم کان پاڪ پاڻيءَ ۾ ٽن راتين تائين پکڙيو ويو، پوءِ ان کي اڌ طاقت واري محلول ۾ رکيو ويو جنهن ۾ 2٪ سوڪروز، 0.05٪ (w/v) MES، ۽ 0.8٪ gellan گم (Fujifilm Wako Pure Chemical) مرشگي.۽ اسڪوگ ميڊيم) پي ايڇ 5.7 سان ۽ مسلسل روشنيءَ هيٺ 23°C تي پکڙيل آهي.
Strain Tak-1 T. Kohchi (ڪيوٽو يونيورسٽي) پاران مهيا ڪيو ويو ۽ جگر جي مطالعي لاء معياري تجرباتي يونٽ طور استعمال ڪيو ويو.Gemma sterilized ڪلچر ٿيل ٻوٽن مان حاصل ڪيو ويو ۽ پوءِ گيمبرگ B5 ميڊيم (فوجيفلم واڪو پيور ڪيميڪل) تي لڳايو ويو جنهن ۾ 1٪ سوڪروز ۽ 0.3٪ گيلان گم ۽ مسلسل روشنيءَ هيٺ 23°C تي انڪيوب ڪيو ويو.
تمباڪو BY-2 سيلز (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (يونيورسٽي آف ٽوڪيو) پاران مهيا ڪيا ويا.BY-2 سيلز کي تبديل ٿيل Linsmeier ۽ Skoog وچولي ۾ 95-گنا گھٽايو ويو ۽ هفتيوار 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 سان گڏ ڪيو ويو.سيل جي معطلي کي 130 rpm تي روٽري شيڪر تي 27 ° C تي اونداهي ۾ ملايو ويو.سيلز کي 10 ڀيرا تازو وچولي جي مقدار سان ڌوء ۽ ساڳئي وچولي ۾ ريزيو.BY-2 ٽرانسجنڪ سيل لائينون مستحڪم طور تي مائڪروٽيوبول مارڪر TagRFP-TUA6 يا actin filament مارڪر GFP-ABD2 کي cauliflower موزيڪ وائرس 35S پروموٽر جي تحت ٺاهيا ويا جيئن بيان ڪيل 33,34,35.اهي سيل لائينون برقرار رکي سگھجن ٿيون ۽ طريقيڪار استعمال ڪندي هم وقت سازي ڪري سگھجن ٿيون جيڪي اصل BY-2 سيل لائن لاءِ استعمال ٿيل آھن.
هيلا سيلز ڊولبيڪو جي تبديل ٿيل ايگلز ميڊيم (DMEM) (لائف ٽيڪنالاجيز) ۾ 10% فيٽل بووائن سيرم، 1.2 U/ml پينسلين، ۽ 1.2 μg/ml streptomycin سان 37°C CO انڪيوبيٽر ۾ 1.2 μg/ml streptomycin سان گڏ ڪيا ويا.
هن نسخي ۾ بيان ڪيل سڀئي تجربا جاپاني جيو حفاظتي ضابطن ۽ هدايتن جي مطابق ڪيا ويا.
مرڪب dimethyl سلفوڪسائيڊ (DMSO؛ Fujifilm Wako Pure Chemical) ۾ حل ڪيا ويا ۽ MS ميڊيم ۾ Arabidopsis ۽ تمباکو يا گيمبرگ B5 ميڊيم لاءِ ليورورٽ لاءِ ملائي ويا.روٽ جي واڌ جي روڪٿام لاءِ، 10 کان وڌيڪ ٻج في پليٽ تي پوکيا ويا اگر ميڊيم تي جن ۾ اشارو ڪيل مرکبات يا DMSO شامل هئا.ٻج 7 ڏينهن تائين ترقي واري چيمبر ۾ پکڙيل هئا.ٻج ڦوٽو ڪڍيا ويا ۽ پاڙن جي ڊگھائي ماپ ڪئي وئي.Arabidopsis germination assay لاءِ، 48 ٻج في پليٽ ايگر ميڊيم تي پوکيا ويا جن ۾ 200 μM مرڪب يا DMSO.Arabidopsis ٻج هڪ ترقي واري چيمبر ۾ پوکيا ويا هئا ۽ ٻجندڙ ٻج جو تعداد 7 ڏينهن بعد شمار ڪيو ويو (ڊيگ).تمباکو جي germination assay لاءِ، 24 ٻج في پليٽ ايگر ميڊيم تي پوکيا ويا جن ۾ 200 μM KAND يا DMSO.تمباکو جي ٻج کي ترقي واري چيمبر ۾ پوکيو ويو ۽ 14 ڏينهن کان پوء انگور ٿيل ٻج جو تعداد شمار ڪيو ويو.جگر جي واڌ جي روڪٿام لاءِ، هر پليٽ مان 9 جنين کي آگر ميڊيم تي لڳايو ويو جنهن ۾ KAND يا DMSO جو اشارو ڏنو ويو ۽ 14 ڏينهن تائين ترقي واري چيمبر ۾ سينگيو ويو.
5 mg/ml propidium iodide (PI) سان داغ ٿيل ٻج استعمال ڪريو روٽ ميريسٽم آرگنائيزيشن کي ڏسڻ لاءِ.PI سگنل فلورسنس مائڪرو اسڪوپي ذريعي مشاهدو ڪيو ويو هڪ TCS SPE ڪنفوڪل ليزر اسڪيننگ مائڪروسکوپ (Leica Microsystems) استعمال ڪندي.
β-glucuronidase (GUS) سان جڙڙن جو هسٽو ڪيميڪل داغ مالامي ۽ بينفي 36 پاران بيان ڪيل پروٽوڪول جي مطابق ڪيو ويو.ٻج کي رات جو 90٪ ايسٽون ۾ مقرر ڪيو ويو، 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid سان 1 ڪلاڪ لاءِ GUS بفر ۾ داغ رکيا ويا ۽ 1 ڪلاڪ لاءِ هائيڊريٽ ٿيل chloraldehyde محلول ۾ رکيا ويا.(8 g کلورل هائيڊريٽ، 2 ml پاڻي ۽ 1 ml گليسرول) ۽ هڪ Axio Imager M1 مائڪرو اسڪوپ (ڪارل زيس) استعمال ڪندي تفريق مداخلت برعڪس مائڪرو اسڪوپي ذريعي مشاهدو ڪيو ويو آهي.
روٽ جي زاوين کي ماپ ڪيو ويو 7-ڏينهن پراڻي ٻج تي عمدي طور تي رکيل پليٽ تي پوکي.ڪشش ثقل ویکٹر جي طرف کان روٽ جي زاوي کي ماپ ڪريو جيئن قدم 6 ۾ بيان ڪيو ويو آهي.
Cortical microtubules جو بندوبست ڏٺو ويو جيئن بيان ڪيو ويو، پروٽوڪول 37 ۾ معمولي تبديلين سان.اينٽي β-ٽيوبلين اينٽي باڊي (KMX-1، مرڪ مليپور: MAB3408) ۽ Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) 1:1000 ۽ 1:100 dilutions تي پرائمري ۽ سيڪنڊري اينٽي باڊيز طور استعمال ڪيا ويا، ترتيب سان.فلورسنس تصويرون هڪ TCS SPE confocal ليزر اسڪيننگ مائڪروسکوپ (Leica Microsystems) استعمال ڪندي حاصل ڪيون ويون.Z-stack تصويرون حاصل ڪريو ۽ ٺاھيندڙ جي هدايتن جي مطابق وڌ ۾ وڌ شدت وارو پروجيڪٽ ٺاھيو.
HeLa سيل جي واڌ ويجهه تي عمل ڪيو ويو سيل ڳڻپ کٽ 8 (Dojindo) استعمال ڪندي ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق.
E. coli DH5α جي واڌ کي ڪلچر ۾ سيل جي کثافت کي ماپڻ سان تجزيو ڪيو ويو 600 nm (OD600) تي اسپيڪٽرفوٽوميٽر استعمال ڪندي.
Cytoskeletal تنظيم transgenic BY-2 سيلز ۾ هڪ فلوروسينس خوردبيني استعمال ڪندي ڏٺو ويو جيڪو هڪ CSU-X1 confocal اسڪيننگ ڊيوائس (Yokogawa) ۽ هڪ sCMOS ڪئميرا (Zyla، Andor ٽيڪنالاجي) سان ليس آهي.Cytoskeletal کثافت جو جائزو ورتو ويو تصويري تجزيي جي ذريعي، جنهن ۾ cytoskeletal پکسلز جي فيصد کي مقدار ۾ ڪيو ويو cytoplasmic پکسلز جي وچ ۾ Confocal تصويرن ۾ ImageJ سافٽ ويئر استعمال ڪندي جيئن بيان ڪيل 38,39.
BY-2 سيلز ۾ سيل جي موت کي ڳولڻ لاء، سيل جي معطلي جي هڪ aliquot کي 0.05٪ Evans blue سان 10 منٽن تائين ڪمري جي حرارت تي لڳايو ويو.مئل سيلز جي چونڊيل ايوانز نيري داغ جو دارومدار پلازما جھلي 40 ذريعي قابل عمل سيلز مان رنگ جي خارج ٿيڻ تي آهي.داغ ٿيل سيلز کي روشن فيلڊ خوردبيني استعمال ڪندي ڏٺو ويو (BX53، اولمپس).
HeLa سيلز DMEM ۾ 10% FBS سان گڏ 37 ° C ۽ 5% CO2 تي نمي ٿيل انڪيوبيٽر ۾ وڌيا ويا.سيلز جو علاج ڪيو ويو 100 μM کنڊ 11، ڪوممونامڪ ايسڊ 6، ڪومامونامائيڊ 1، 100 ng/ml colcemid (Gibco)، يا 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) 6 h لاءِ 37 ° C تي.سيلز کي 10 منٽ لاءِ MetOH سان مقرر ڪيو ويو ۽ پوءِ ڪمري جي حرارت تي 5 منٽ لاءِ ايڪٽيٽ سان.فڪسڊ سيلز کي β-ٽيوبلين پرائمري اينٽي باڊي (1D4A4، پروٽينٽيڪ: 66240-1) 0.5٪ BSA/PBS ۾ 2 ڪلاڪن لاءِ ملائي، 3 ڀيرا TBST سان ڌويو ويو، ۽ پوءِ Alexa Fluor بکري اينٽي باڊي سان لڳايو ويو.488 1 ڪلاڪ.- ماؤس IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ۽ 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.5% BSA/PBS ۾ ملائي.ٽي بي ايس ٽي سان ڌوئڻ کان پوءِ، داغ ٿيل سيلز کي Nikon Eclipse Ti-E الٽي خوردبيني تي ڏٺو ويو.MetaMorph سافٽ ويئر (Molecular Devices) استعمال ڪندي تصويرن کي ٿڌي Hamamatsu ORCA-R2 CCD ڪئميرا سان پڪڙيو ويو.
پوسٽ ٽائيم: جون-17-2024