مقداري گبريلين بايوسينسر شوٽ ايپيڪل ميرسٽم ۾ انٽرنوڊ وضاحت ۾ گبريلين جي ڪردار کي ظاهر ڪري ٿو.

شاخ جي چوٽي جي ميرسٽم (SAM) جي واڌ اسٽيم جي جوڙجڪ لاءِ اهم آهي. ٻوٽن جا هارمونگِبريلين(GAs) ٻوٽن جي واڌ ويجهه کي هم آهنگ ڪرڻ ۾ اهم ڪردار ادا ڪن ٿا، پر SAM ۾ انهن جو ڪردار خراب طور تي سمجهي ويو آهي. هتي، اسان GA سگنلنگ جو هڪ ريٽيوميٽرڪ بايوسينسر تيار ڪيو آهي DELLA پروٽين کي انجنيئرنگ ڪندي GA ٽرانسڪرپشنل ردعمل ۾ ان جي ضروري ريگيوليٽري فنڪشن کي دٻائڻ لاءِ جڏهن ته GA جي سڃاڻپ تي ان جي خرابي کي محفوظ رکڻ لاءِ. اسان اهو ظاهر ڪريون ٿا ته هي خرابي تي ٻڌل بايوسينسر ترقي دوران GA جي سطحن ۽ سيلولر سينسنگ ۾ تبديلين کي صحيح طور تي رڪارڊ ڪري ٿو. اسان هن بايوسينسر کي SAM ۾ GA سگنلنگ سرگرمي کي نقشي ۾ استعمال ڪيو. اسان ڏيکاريون ٿا ته اعليٰ GA سگنل بنيادي طور تي عضون جي پرائمورڊيا جي وچ ۾ واقع سيلز ۾ موجود آهن، جيڪي انٽرنوڊ سيلز جا اڳوڻا آهن. حاصل ڪرڻ ۽ ڪم ڪرڻ جي نقصان جي طريقن کي استعمال ڪندي، اسان وڌيڪ ظاهر ڪريون ٿا ته GA سيل ڊويزن جهاز جي رخ کي منظم ڪري ٿو، انٽرنوڊ جي ڪيننيڪل سيلولر تنظيم قائم ڪري ٿو، ان ڪري SAM ۾ انٽرنوڊ وضاحت کي فروغ ڏئي ٿو.
شوٽ ايپيڪل ميرسٽم (SAM)، جيڪو شوٽ جي چوٽي تي واقع آهي، اسٽيم سيلز جو هڪ طاق تي مشتمل آهي جنهن جي سرگرمي ٻوٽي جي سڄي زندگي ۾ هڪ ماڊيولر ۽ ٻيهر ورجائيندڙ انداز ۾ پس منظر جي عضون ۽ اسٽيم نوڊس پيدا ڪري ٿي. انهن مان هر هڪ ورجائيندڙ يونٽ، يا ٻوٽي جي نوڊس ۾، نوڊس تي انٽرنوڊس ۽ پس منظر جي عضون شامل آهن، ۽ پتي جي محور ۾ محوري ميرسٽم 1. ترقي دوران ٻوٽن جي نوڊس جي واڌ ۽ تنظيم تبديل ٿيندي آهي. Arabidopsis ۾، انٽرنوڊل واڌ کي ٻوٽي جي مرحلي دوران دٻايو ويندو آهي، ۽ محوري ميرسٽم گلاب جي پنن جي محور ۾ غير فعال رهندا آهن. گلن جي مرحلي ۾ منتقلي دوران، SAM انفلورسي ميرسٽم بڻجي ويندو آهي، جيڪو ڊگھا انٽرنوڊس ۽ محوري ڪليون، ڪولين پنن جي محور ۾ شاخون، ۽ بعد ۾، پنن کان سواءِ گل 2 پيدا ڪندو آهي. جيتوڻيڪ اسان انهن ميڪانيزم کي سمجهڻ ۾ اهم ترقي ڪئي آهي جيڪي پنن، گلن ۽ شاخن جي شروعات کي ڪنٽرول ڪن ٿا، انٽرنوڊس ڪيئن پيدا ٿين ٿا ان بابت نسبتاً گهٽ ڄاڻ آهي.
GA جي اسپيٽيوٽيمپورل ورڇ کي سمجهڻ سان مختلف ٽشوز ۽ مختلف ترقياتي مرحلن ۾ انهن هارمونز جي ڪمن کي بهتر سمجهڻ ۾ مدد ملندي. ان جي پنهنجي پروموٽر جي عمل هيٺ ظاهر ڪيل RGA-GFP فيوزن جي تباهي جو تصور روٽ 15,16 ۾ ڪل GA ليولز جي ضابطي تي اهم معلومات فراهم ڪري ٿو. بهرحال، RGA اظهار ٽشوز 17 ۾ مختلف آهي ۽ GA18 پاران منظم ڪيو ويندو آهي. اهڙيءَ طرح، RGA پروموٽر جي فرق واري اظهار جي نتيجي ۾ RGA-GFP سان مشاهدو ڪيل فلوروسينس نموني ٿي سگهي ٿو ۽ ان ڪري هي طريقو مقداري ناهي. تازو، بايو ايڪٽو فلوروسين (Fl)-ليبل ٿيل GA19,20 روٽ اينڊوڪارٽيڪس ۾ GA جي جمع ٿيڻ ۽ GA ٽرانسپورٽ ذريعي ان جي سيلولر سطحن جي ضابطي کي ظاهر ڪيو. تازو، GA FRET سينسر nlsGPS1 ڏيکاريو ته GA ليولز جڙڙن، فلامنٽس، ۽ اونداهي-وڌندڙ هائپوڪوٽائلز 21 ۾ سيل جي ڊيگهه سان لاڳاپيل آهن. بهرحال، جيئن اسان ڏٺو آهي، GA ڪنسنٽريشن واحد پيرا ميٽر ناهي جيڪو GA سگنلنگ سرگرمي کي ڪنٽرول ڪري ٿو، ڇاڪاڻ ته اهو پيچيده سينسنگ عملن تي منحصر آهي. هتي، DELLA ۽ GA سگنلنگ رستن جي اسان جي سمجھ تي تعمير ڪندي، اسان GA سگنلنگ لاءِ هڪ ڊيگريڊيشن تي ٻڌل ريٽيوميٽرڪ بايوسينسر جي ترقي ۽ خاصيت جي رپورٽ ڪريون ٿا. هن مقداري بايوسينسر کي ترقي ڪرڻ لاءِ، اسان هڪ ميوٽنٽ GA-حساس RGA استعمال ڪيو جيڪو هڪ فلوروسينٽ پروٽين سان ملائي ويو ۽ ٽشوز ۾ هر هنڌ ظاهر ڪيو ويو، انهي سان گڏ هڪ GA-غير حساس فلوروسينٽ پروٽين. اسان ڏيکاريون ٿا ته ميوٽنٽ RGA پروٽين فيوزن اينڊوجينس GA سگنلنگ ۾ مداخلت نه ڪندا آهن جڏهن هر هنڌ ظاهر ڪيو ويندو آهي، ۽ اهو ته هي بايوسينسر GA ان پٽ ۽ GA سگنل پروسيسنگ جي نتيجي ۾ سگنلنگ سرگرمي کي مقدار ڏئي سگهي ٿو جيڪو سينسنگ اپريٽس پاران اعلي اسپيٽيوٽيمپورل ريزوليوشن سان. اسان هن بايوسينسر کي GA سگنلنگ سرگرمي جي اسپيٽيوٽيمپورل ورڇ کي نقشي ڪرڻ ۽ اهو مقدار ڏيڻ لاءِ استعمال ڪيو ته GA SAM ايپيڊرمس ۾ سيلولر رويي کي ڪيئن منظم ڪري ٿو. اسان اهو ظاهر ڪريون ٿا ته GA عضوي پرائمورڊيا جي وچ ۾ واقع SAM سيلز جي ڊويزن جهاز جي رخ کي منظم ڪري ٿو، ان ڪري انٽرنڊ جي ڪيننيڪل سيلولر تنظيم کي بيان ڪري ٿو.
آخرڪار، اسان پڇيو ته ڇا qmRGA وڌندڙ هائپوڪوٽائل استعمال ڪندي اندروني GA جي سطحن ۾ تبديلين جي رپورٽ ڪري سگهي ٿو. اسان اڳ ۾ ڏيکاريو ته نائٽريٽ GA جي جوڙجڪ کي وڌائي ۽، بدلي ۾، DELLA34 جي خرابي سان واڌ کي متحرڪ ڪري ٿو. ان مطابق، اسان ڏٺو ته pUBQ10::qmRGA ٻج ۾ هائپوڪوٽائل جي ڊيگهه گهڻي مقدار ۾ نائٽريٽ جي فراهمي (10 mM NO3−) هيٺ پوکيل ٻج ۾ نائٽريٽ جي گهٽتائي واري حالتن ۾ پوکيل ٻج جي ڀيٽ ۾ تمام گهڻي هئي (ضمني شڪل 6a). واڌ جي جواب سان مطابقت، GA سگنل 10 mM NO3− حالتن هيٺ پوکيل ٻج جي هائپوڪوٽائل ۾ وڌيڪ هئا جيڪي نائٽريٽ جي غير موجودگي ۾ پوکيل ٻج جي ڀيٽ ۾ (اضافي شڪل 6b، c). ان ڪري، qmRGA GA ڪنسنٽريشن ۾ اندروني تبديلين جي ڪري GA سگنلنگ ۾ تبديلين جي نگراني کي پڻ قابل بڻائي ٿو.
اهو سمجهڻ لاءِ ته ڇا qmRGA پاران معلوم ڪيل GA سگنلنگ سرگرمي GA ڪنسنٽريشن ۽ GA تصور تي منحصر آهي، جيئن سينسر ڊيزائن جي بنياد تي توقع ڪئي وئي هئي، اسان نباتاتي ۽ توليدي بافتن ۾ ٽن GID1 ريڪٽرز جي اظهار جو تجزيو ڪيو. ٻج ۾، GID1-GUS رپورٽر لائن ڏيکاريو ته GID1a ۽ c ڪوٽيلڊن ۾ تمام گهڻو ظاهر ڪيا ويا هئا (شڪل 3a-c). ان کان علاوه، سڀئي ٽي ريڪٽرز پنن، ليٽرل روٽ پرائمورڊيا، روٽ ٽوپس (GID1b جي روٽ ڪيپ کان سواءِ)، ۽ ويسڪولر سسٽم (شڪل 3a-c) ۾ ظاهر ڪيا ويا. انفلورسينس SAM ۾، اسان صرف GID1b ۽ 1c لاءِ GUS سگنل ڳولي لڌا (ضمني شڪل 7a-c). ان سيٽو هائبرڊائيزيشن انهن اظهار جي نمونن جي تصديق ڪئي ۽ وڌيڪ ظاهر ڪيو ته GID1c SAM ۾ گهٽ سطحن تي هڪجهڙائي سان ظاهر ڪيو ويو، جڏهن ته GID1b SAM جي پردي تي وڌيڪ اظهار ڏيکاريو (ضمني شڪل 7d-l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b ٽرانسليشنل فيوزن پڻ GID1b اظهار جي هڪ درجه بندي رينج کي ظاهر ڪيو، SAM جي مرڪز ۾ گهٽ يا ڪابه اظهار کان وٺي عضون جي سرحدن تي اعلي اظهار تائين (ضمني شڪل 7m). اهڙيءَ طرح، GID1 ريڪٽرز ٽشوز ۾ ۽ اندر هڪجهڙائي سان ورهايل نه آهن. بعد ۾ تجربن ۾، اسان اهو پڻ ڏٺو ته GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) جي اوور ايڪسپريشن هائپوڪوٽائلز ۾ qmRGA جي حساسيت کي خارجي GA ايپليڪيشن ڏانهن وڌايو (شڪل 3d، e). ان جي ابتڙ، هائپوڪوٽائل ۾ qd17mRGA پاران ماپيل فلوروسينس GA3 علاج لاءِ غير حساس هو (شڪل 3f، g). ٻنهي ٽيسٽن لاءِ، سينسر جي تيز رويي جو جائزو وٺڻ لاءِ ٻج کي GA (100 μM GA3) جي اعلي ڪنسنٽريشن سان علاج ڪيو ويو، جتي GID1 ريڪٽر سان ڳنڍڻ جي صلاحيت وڌي وئي يا گم ٿي وئي. گڏجي، اهي نتيجا تصديق ڪن ٿا ته qmRGA بايوسينسر GA ۽ GA سينسر جي طور تي گڏيل ڪم ڪري ٿو، ۽ اهو مشورو ڏئي ٿو ته GID1 ريڪٽر جو فرق اظهار سينسر جي اخراج کي خاص طور تي تبديل ڪري سگهي ٿو.
اڄ تائين، SAM ۾ GA سگنلن جي ورڇ واضح نه رهي آهي. تنهن ڪري، اسان qmRGA-اظهار ڪندڙ ٻوٽن ۽ pCLV3::mCherry-NLS اسٽيم سيل رپورٽر 35 کي استعمال ڪيو ته جيئن GA سگنلنگ سرگرمي جي اعليٰ ريزوليوشن مقداري نقشن کي ڳڻيو وڃي، L1 پرت تي ڌيان ڏنو وڃي (ايپيڊرمس؛ شڪل 4a، b، طريقا ۽ اضافي طريقا ڏسو)، ڇاڪاڻ ته L1 SAM واڌ کي ڪنٽرول ڪرڻ ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو 36. هتي، pCLV3::mCherry-NLS اظهار GA سگنلنگ سرگرمي 37 جي اسپيٽيوٽيمپورل ورڇ جي تجزيي لاءِ هڪ مقرر جاميٽري ريفرنس پوائنٽ فراهم ڪيو. جيتوڻيڪ GA کي پس منظر جي عضون جي ترقي لاءِ ضروري سمجهيو ويندو آهي 4، اسان ڏٺو ته GA سگنل P3 اسٽيج کان شروع ٿيندڙ فلورل پرائمورڊيم (P) ۾ گهٽ هئا (شڪل 4a، b)، جڏهن ته نوجوان P1 ۽ P2 پرائمورڊيم ۾ مرڪزي علائقي جي برابر اعتدال پسند سرگرمي هئي (شڪل 4a، b). اعضاء جي پرائمورڊيم حدن تي وڌيڪ GA سگنلنگ سرگرمي معلوم ڪئي وئي، جيڪا P1/P2 (حد جي پاسن تي) کان شروع ٿي ۽ P4 تي چوٽي تي پهتي، انهي سان گڏ پرائمورڊيا جي وچ ۾ واقع پردي واري علائقي جي سڀني سيلن ۾ (شڪل 4a، b ۽ ضمني شڪل 8a، b). هي اعليٰ GA سگنلنگ سرگرمي نه رڳو ايپيڊرمس ۾ پر L2 ۽ مٿين L3 تہن ۾ پڻ ڏٺي وئي (ضمني شڪل 8b). qmRGA استعمال ڪندي SAM ۾ GA سگنلن جو نمونو پڻ وقت سان گڏ تبديل نه ٿيو (ضمني شڪل 8c-f، k). جيتوڻيڪ qd17mRGA تعمير کي منظم طور تي T3 ٻوٽن جي SAM ۾ پنجن آزاد لائينن مان گھٽايو ويو جيڪي اسان تفصيل سان بيان ڪيون، اسان pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP تعمير سان حاصل ڪيل فلوروسينس نمونن جو تجزيو ڪرڻ جي قابل هئاسين (اضافي شڪل 8g-j، l). هن ڪنٽرول لائن ۾، SAM ۾ فلوروسينس تناسب ۾ صرف معمولي تبديليون معلوم ڪيون ويون، پر SAM مرڪز ۾ اسان TagBFP سان لاڳاپيل VENUS ۾ هڪ واضح ۽ غير متوقع گهٽتائي ڏٺي. هي تصديق ڪري ٿو ته qmRGA پاران مشاهدو ڪيل سگنلنگ نمونو mRGA-VENUS جي GA-انحصار خرابي کي ظاهر ڪري ٿو، پر اهو پڻ ظاهر ڪري ٿو ته qmRGA ميرسٽم سينٽر ۾ GA سگنلنگ سرگرمي کي وڌيڪ اندازو لڳائي سگهي ٿو. خلاصو، اسان جا نتيجا هڪ GA سگنلنگ نمونو ظاهر ڪن ٿا جيڪو بنيادي طور تي پرائمورڊيا جي ورڇ کي ظاهر ڪري ٿو. انٽر-پرائمورڊيل علائقي (IPR) جي هي ورڇ ترقي پذير پرائمورڊيم ۽ مرڪزي علائقي جي وچ ۾ اعلي GA سگنلنگ سرگرمي جي بتدريج قيام جي ڪري آهي، جڏهن ته ساڳئي وقت پرائمورڊيم ۾ GA سگنلنگ سرگرمي گهٽجي ٿي (شڪل 4c، d).
GID1b ۽ GID1c ريڪٽرز جي ورڇ (مٿي ڏسو) مان ظاهر ٿئي ٿو ته GA ريڪٽرز جو فرقيوار اظهار SAM ۾ GA سگنلنگ سرگرمي جي نموني کي شڪل ڏيڻ ۾ مدد ڪري ٿو. اسان حيران ٿياسين ته ڇا GA جو فرقيوار جمع شامل ٿي سگهي ٿو. هن امڪان جي جاچ ڪرڻ لاءِ، اسان nlsGPS1 GA FRET سينسر 21 استعمال ڪيو. 100 منٽن لاءِ 10 μM GA4+7 سان علاج ڪيل nlsGPS1 جي SAM ۾ وڌندڙ چالو ڪرڻ جي فريڪوئنسي جو پتو لڳايو ويو (ضمني شڪل 9a–e)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته nlsGPS1 SAM ۾ GA ڪنسنٽريشن ۾ تبديلين جو جواب ڏئي ٿو، جيئن اهو روٽس ۾ ڪندو آهي 21. nlsGPS1 چالو ڪرڻ جي فريڪوئنسي جي مقامي ورڇ SAM جي ٻاهرين پرتن ۾ نسبتا گهٽ GA سطحن کي ظاهر ڪيو، پر اهو ظاهر ڪيو ته اهي مرڪز ۾ ۽ SAM جي سرحدن تي بلند هئا (شڪل 4e ۽ ضمني شڪل 9a،c). اهو ظاهر ڪري ٿو ته GA پڻ SAM ۾ هڪ مقامي نموني سان ورهايو ويو آهي جيڪو qmRGA پاران ظاهر ڪيل سان مقابلو ڪري سگهجي ٿو. هڪ مڪمل طريقي جي طور تي، اسان SAM کي فلوروسينٽ GA (GA3-، GA4-، GA7-Fl) يا صرف Fl سان منفي ڪنٽرول طور علاج ڪيو. Fl سگنل سڄي SAM ۾ ورهايو ويو، جنهن ۾ مرڪزي علائقو ۽ پرائمورڊيم شامل آهن، جيتوڻيڪ گهٽ شدت تي (شڪل 4j ۽ ضمني شڪل 10d). ان جي ابتڙ، سڀئي ٽي GA-Fl خاص طور تي پرائمورڊيم سرحدن اندر ۽ باقي IPR ۾ مختلف درجن تائين گڏ ٿيا، GA7-Fl IPR ۾ سڀ کان وڏي ڊومين ۾ جمع ٿيو (شڪل 4k ۽ ضمني شڪل 10a،b). فلوروسينس شدت جي مقدار جو اندازو لڳايو ته IPR کان غير IPR شدت جو تناسب GA-Fl- علاج ٿيل SAM ۾ Fl- علاج ٿيل SAM (شڪل 4l ۽ ضمني شڪل 10c) جي مقابلي ۾ وڌيڪ هو. گڏو گڏ، اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته GA عضوي سرحد جي ويجهو واقع IPR سيلز ۾ وڌيڪ ڪنسنٽريشن تي موجود آهي. ان مان ظاهر ٿئي ٿو ته SAM GA سگنلنگ سرگرمي جو نمونو GA ريڪٽرز جي فرق جي اظهار ۽ عضون جي سرحدن جي ويجهو IPR سيلز ۾ GA جي فرق جي جمع ٿيڻ جو نتيجو آهي. اهڙيءَ طرح، اسان جي تجزيي GA سگنلنگ جي هڪ غير متوقع اسپيٽيوٽيمپورل نموني کي ظاهر ڪيو، جنهن ۾ SAM جي مرڪز ۽ پرائمورڊيم ۾ گهٽ سرگرمي ۽ پردي واري علائقي ۾ IPR ۾ وڌيڪ سرگرمي هئي.
SAM ۾ فرق واري GA سگنلنگ سرگرمي جي ڪردار کي سمجهڻ لاءِ، اسان SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS جي ريئل ٽائيم ٽائيم-ليپس اميجنگ استعمال ڪندي GA سگنلنگ سرگرمي، سيل جي توسيع، ۽ سيل ڊويزن جي وچ ۾ لاڳاپي جو تجزيو ڪيو. واڌ جي ضابطي ۾ GA جي ڪردار کي ڏنو ويو، سيل جي توسيع جي پيرا ميٽرز سان هڪ مثبت لاڳاپو متوقع هو. تنهن ڪري، اسان پهريون ڀيرو GA سگنلنگ سرگرمي نقشن جو مقابلو سيل جي مٿاڇري جي واڌ جي شرح جي نقشن سان ڪيو (هڪ ڏنل سيل لاءِ ۽ ڊويزن تي ڌيئر سيلز لاءِ سيل جي توسيع جي طاقت لاءِ پراڪسي جي طور تي) ۽ واڌ اينيسوٽروپي جي نقشن سان، جيڪو سيل جي توسيع جي هدايت کي ماپيندو آهي (هتي ڏنل سيل لاءِ ۽ ڊويزن تي ڌيئر سيلز لاءِ پڻ استعمال ڪيو ويو آهي؛ شڪل 5a، b، طريقا ۽ اضافي طريقا ڏسو). SAM سيل جي مٿاڇري جي واڌ جي شرح جا اسان جا نقشا پوئين مشاهدن سان مطابقت رکن ٿا 38،39، سرحد تي گهٽ ۾ گهٽ واڌ جي شرح ۽ ترقي پذير گلن ۾ وڌ ۾ وڌ واڌ جي شرح سان (شڪل 5a). پرنسپل جزو تجزيو (PCA) ڏيکاريو ته GA سگنلنگ سرگرمي منفي طور تي سيل جي مٿاڇري جي واڌ جي شدت سان لاڳاپيل هئي (شڪل 5c). اسان اهو پڻ ڏيکاريو ته تبديلي جا مکيه محور، جن ۾ GA سگنلنگ ان پٽ ۽ واڌ جي شدت شامل آهي، اعلي CLV3 اظهار پاران طئي ڪيل هدايت ڏانهن آرٿوگونل هئا، باقي تجزين ۾ SAM مرڪز مان سيلز جي خارج ٿيڻ جي تصديق ڪن ٿا. اسپيئرمين رابطي جي تجزيي PCA نتيجن جي تصديق ڪئي (شڪل 5d)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته IPR ۾ اعلي GA سگنلز اعلي سيل جي توسيع جو نتيجو نه هئا. بهرحال، رابطي جي تجزيي GA سگنلنگ سرگرمي ۽ واڌ اينيسوٽروپي (شڪل 5c، d) جي وچ ۾ هڪ معمولي مثبت رابطي کي ظاهر ڪيو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته IPR ۾ اعلي GA سگنلنگ سيل جي واڌ جي هدايت ۽ ممڪن طور تي سيل ڊويزن جهاز جي پوزيشن کي متاثر ڪري ٿو.
a، b SAM ۾ سراسري سطح جي واڌ (a) ۽ واڌ اينيسوٽروپي (b) جا گرمي نقشا سراسري طور تي ست آزاد ٻوٽن کان وڌيڪ هئا (ترتيب سان سيل جي واڌ جي طاقت ۽ هدايت لاءِ پراڪسيز طور استعمال ڪيا ويا). c PCA تجزيي ۾ هيٺيان متغير شامل هئا: GA سگنل، مٿاڇري جي واڌ جي شدت، مٿاڇري جي واڌ اينيسوٽروپي، ۽ CLV3 اظهار. PCA جزو 1 بنيادي طور تي سطح جي واڌ جي شدت سان منفي طور تي لاڳاپيل هو ۽ GA سگنل سان مثبت طور تي لاڳاپيل هو. PCA جزو 2 بنيادي طور تي سطح جي واڌ اينيسوٽروپي سان مثبت طور تي لاڳاپيل هو ۽ CLV3 اظهار سان منفي طور تي لاڳاپيل هو. فيصد هر جزو پاران بيان ڪيل تبديلي جي نمائندگي ڪن ٿا. d GA سگنل جي وچ ۾ اسپيئرمين رابطي جو تجزيو، مٿاڇري جي واڌ جي شدت، ۽ سطح جي واڌ اينيسوٽروپي ٽشو اسڪيل تي CZ کي ڇڏي. ساڄي پاسي نمبر ٻن متغيرن جي وچ ۾ اسپيئرمين rho قدر آهي. ستارا اهڙن ڪيسن کي ظاهر ڪن ٿا جتي رابطي/منفي رابطي انتهائي اهم آهي. e ڪنفوڪل مائڪروسڪوپي ذريعي Col-0 SAM L1 سيلز جو 3D تصور. 10 ڪلاڪ تي SAM (پر پرائمورڊيم نه) ۾ ٺهيل نئين سيل والز انهن جي زاوي قدرن مطابق رنگين آهن. رنگ بار هيٺئين ساڄي ڪنڊ ۾ ڏيکاريو ويو آهي. انسيٽ 0 ڪلاڪ تي لاڳاپيل 3D تصوير ڏيکاري ٿو. تجربو ٻه ڀيرا ساڳئي نتيجن سان ورجايو ويو. f باڪس پلاٽ IPR ۽ غير IPR ڪال-0 SAM (n = 10 آزاد ٻوٽا) ۾ سيل ڊويزن جي شرح ڏيکاري ٿو. سينٽر لائن ميڊين ڏيکاري ٿي، ۽ باڪس جون حدون 25 هين ۽ 75 هين فيصد جي نشاندهي ڪن ٿيون. وسڪرز R سافٽ ويئر سان طئي ٿيل گهٽ ۾ گهٽ ۽ وڌ ۾ وڌ قدرن کي ظاهر ڪن ٿا. P قدر ويلچ جي ٻن-ٽيل ٽي-ٽيسٽ سان حاصل ڪيا ويا. g، h اسڪيميٽڪ ڊاگرام ڏيکاري ٿو (g) SAM جي مرڪز کان ريڊيل هدايت جي حوالي سان نئين سيل وال (ميجنٽا) جي زاوي کي ڪيئن ماپجي (سفيد ڊاٽ ٿيل لائن) (صرف تيز زاوي قدر، يعني 0-90°، سمجهيو ويندو آهي)، ۽ (h) ميرسٽم اندر گهيرو/پس منظر ۽ ريڊيل هدايتون. i SAM (ڪارو نيرو)، IPR (وچولي نيرو)، ۽ غير IPR (هلڪو نيرو) ۾ سيل ڊويزن جهاز جي رخ جي فريڪوئنسي هسٽوگرام ترتيب وار. P قدر ٻن دم واري ڪولموگوروف-سميرنوف ٽيسٽ ذريعي حاصل ڪيا ويا. تجربو ٻه ڀيرا ساڳئي نتيجن سان ورجايو ويو. j IPR جي سيل ڊويزن جهاز جي رخ جي فريڪوئنسي هسٽوگرام ترتيب وار P3 (هلڪو سائو)، P4 (وچولي سائو)، ۽ P5 (گهرو سائو) جي چوڌاري. P قدر ٻن دم واري ڪولموگوروف-سميرنوف ٽيسٽ ذريعي حاصل ڪيا ويا. تجربو ٻه ڀيرا ساڳئي نتيجن سان ورجايو ويو.
تنهن ڪري، اسان اڳتي هلي GA سگنلنگ ۽ سيل ڊويزن سرگرمي جي وچ ۾ لاڳاپي جي جاچ ڪئي، جاچ دوران نئين ٺهيل سيل والز جي سڃاڻپ ڪندي (شڪل 5e). هن طريقي سان اسان کي سيل ڊويزن جي فريڪوئنسي ۽ هدايت کي ماپڻ جي اجازت ملي. حيرت انگيز طور تي، اسان ڏٺو ته IPR ۽ باقي SAM (غير IPR، شڪل 5f) ۾ سيل ڊويزن جي فريڪوئنسي ساڳي هئي، اهو ظاهر ڪري ٿي ته IPR ۽ غير IPR سيلز جي وچ ۾ GA سگنلنگ ۾ فرق سيل ڊويزن کي خاص طور تي متاثر نه ڪندا آهن. هي، ۽ GA سگنلنگ ۽ واڌ اينيسوٽروپي جي وچ ۾ مثبت لاڳاپو، اسان کي غور ڪرڻ تي مجبور ڪيو ته ڇا GA سگنلنگ سرگرمي سيل ڊويزن جهاز جي رخ کي متاثر ڪري سگهي ٿي. اسان نئين سيل وال جي رخ کي ميرسٽم سينٽر ۽ نئين سيل وال جي مرڪز کي ڳنڍيندڙ ريڊيل محور جي نسبت هڪ تيز زاويه جي طور تي ماپيو (شڪل 5e-i) ۽ ريڊيل محور جي نسبت 90° جي ويجهو زاوين تي سيلز جي ورهاست جو واضح رجحان ڏٺو، جنهن ۾ سڀ کان وڌيڪ تعدد 70-80° (23.28%) ۽ 80-90° (22.62%) (شڪل 5e,i) تي ڏٺو ويو، جيڪو گردش/ٽرانسورس هدايت ۾ سيل ڊويزن جي مطابق آهي (شڪل 5h). هن سيل ڊويزن رويي ۾ GA سگنلنگ جي تعاون کي جانچڻ لاءِ، اسان IPR ۽ غير IPR ۾ سيل ڊويزن پيرا ميٽرز جو الڳ الڳ تجزيو ڪيو (شڪل 5i). اسان ڏٺو ته IPR سيلز ۾ ڊويزن اينگل ورڇ غير IPR سيلز يا پوري SAM ۾ سيلز کان مختلف هئي، IPR سيلز ۾ ليٽرل/سرڪيولر سيل ڊويزن جو وڌيڪ تناسب ڏيکاريو ويو، يعني 70-80° ۽ 80-90° (ترتيب سان 33.86% ۽ 30.71%، لاڳاپيل تناسب) (شڪل 5i). اهڙيءَ طرح، اسان جي مشاهدن ۾ اعليٰ GA سگنلنگ ۽ سيل ڊويزن جهاز جي واقفيت جي وچ ۾ هڪ تعلق ظاهر ٿيو جيڪو گهيرو طرف ويجهو آهي، GA سگنلنگ سرگرمي ۽ واڌ اينيسوٽروپي جي وچ ۾ لاڳاپي جي برابر آهي (شڪل 5c، d). هن ايسوسيئيشن جي مقامي تحفظ کي وڌيڪ قائم ڪرڻ لاءِ، اسان P3 کان شروع ٿيندڙ پرائمورڊيم جي چوڌاري IPR سيلز ۾ ڊويزن جهاز جي واقفيت کي ماپيو، ڇاڪاڻ ته P4 کان شروع ٿيندڙ هن علائقي ۾ سڀ کان وڌيڪ GA سگنلنگ سرگرمي معلوم ڪئي وئي هئي (شڪل 4). P3 ۽ P4 جي چوڌاري IPR جي ڊويزن زاوين ڪو به شمارياتي طور تي اهم فرق نه ڏيکاريو، جيتوڻيڪ P4 جي چوڌاري IPR ۾ ليٽرل سيل ڊويزن جي وڌندڙ تعدد کي ڏٺو ويو (شڪل 5j). جڏهن ته، P5 جي چوڌاري IPR سيلز ۾، سيل ڊويزن جهاز جي رخ ۾ فرق شمارياتي طور تي اهم ٿي ويو، ٽرانسورس سيل ڊويزن جي تعدد ۾ تيز واڌ سان (شڪل 5j). گڏو گڏ، اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته GA سگنلنگ SAM ۾ سيل ڊويزن جي رخ کي ڪنٽرول ڪري سگهي ٿو، جيڪو پوئين رپورٽن سان مطابقت رکي ٿو40,41 ته اعليٰ GA سگنلنگ IPR ۾ سيل ڊويزن جي پس منظر جي رخ کي متاثر ڪري سگهي ٿو.
اهو اڳڪٿي ڪئي وئي آهي ته IPR ۾ سيلز کي پرائمورڊيا ۾ شامل نه ڪيو ويندو پر انٽرنوڊس 2,42,43 ۾. IPR ۾ سيل ڊويزن جي ٽرانسورس اورينٽيشن جي نتيجي ۾ انٽرنوڊس ۾ ايپيڊرمل سيلز جي متوازي طول بلد قطارن جي عام تنظيم ٿي سگهي ٿي. مٿي بيان ڪيل اسان جا مشاهدا اهو ظاهر ڪن ٿا ته GA سگنلنگ شايد سيل ڊويزن جي هدايت کي منظم ڪندي هن عمل ۾ ڪردار ادا ڪري ٿو.
ڪيترن ئي DELLA جينز جي ڪم جي نقصان جي نتيجي ۾ هڪ آئيني GA ردعمل پيدا ٿئي ٿو، ۽ ڊيلا ميوٽنٽ هن مفروضي کي جانچڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجن ٿا44. اسان پهريون ڀيرو SAM ۾ پنجن DELLA جينز جي اظهار جي نمونن جو تجزيو ڪيو. GUS لائن45 جي ٽرانسڪرپشنل فيوزن ظاهر ڪيو ته GAI، RGA، RGL1، ۽ RGL2 (تمام گهٽ حد تائين) SAM ۾ ظاهر ڪيا ويا (ضمني شڪل 11a–d). ان سيٽو هائبرڊائيزيشن وڌيڪ ظاهر ڪيو ته GAI mRNA خاص طور تي پرائمورڊيا ۽ ترقي ڪندڙ گلن ۾ جمع ٿئي ٿو (ضمني شڪل 11e). RGL1 ۽ RGL3 mRNA سڄي SAM ڪينوپي ۽ پراڻن گلن ۾ دريافت ڪيا ويا، جڏهن ته RGL2 mRNA سرحدي علائقي ۾ وڌيڪ وافر هو (ضمني شڪل 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM جي ڪنفوڪل اميجنگ ان سيٽو هائبرڊائيزيشن پاران مشاهدو ڪيل اظهار جي تصديق ڪئي ۽ ڏيکاريو ته RGL3 پروٽين SAM جي مرڪزي حصي ۾ جمع ٿئي ٿو (ضمني شڪل 11i). pRGA::GFP-RGA لائن استعمال ڪندي، اسان اهو پڻ ڏٺو ته RGA پروٽين SAM ۾ جمع ٿئي ٿو، پر ان جي گهڻائي P4 کان شروع ٿيندڙ سرحد تي گهٽجي ٿي (ضمني شڪل 11j). خاص طور تي، RGL3 ۽ RGA جا اظهار جا نمونا IPR ۾ اعليٰ GA سگنلنگ سرگرمي سان مطابقت رکن ٿا، جيئن qmRGA (شڪل 4) پاران معلوم ڪيو ويو آهي. ان کان علاوه، اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته سڀئي DELLA SAM ۾ ظاهر ڪيا ويا آهن ۽ انهن جو اظهار مجموعي طور تي پوري SAM تي پکڙيل آهي.
اسان اڳتي هلي جهنگلي قسم جي SAM (Ler، ڪنٽرول) ۽ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 ڊيلا ڪوئنٽپل (گلوبل) ميوٽنٽ (شڪل 6a، b) ۾ سيل ڊويزن پيرا ميٽرز جو تجزيو ڪيو. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، اسان جهنگلي قسم (شڪل 6c) جي مقابلي ۾ ڊيلا گلوبل ميوٽنٽ SAM ۾ سيل ڊويزن اينگل فريڪوئنسي جي ورڇ ۾ هڪ شمارياتي طور تي اهم تبديلي ڏٺي. ڊيلا گلوبل ميوٽنٽ ۾ هي تبديلي 80-90° زاوين (34.71% بمقابله 24.55%) جي فريڪوئنسي ۾ واڌ ۽، گهٽ حد تائين، 70-80° زاوين (23.78% بمقابله 20.18%) جي فريڪوئنسي ۾ واڌ جي ڪري هئي، يعني، ٽرانسورس سيل ڊويزن (شڪل 6c) جي مطابق. غير ٽرانسورس ڊويزن (0-60°) جي فريڪوئنسي ڊيلا گلوبل ميوٽنٽ (شڪل 6c) ۾ پڻ گهٽ هئي. ڊيلا گلوبل ميوٽنٽ (شڪل 6b) جي SAM ۾ ٽرانسورس سيل ڊويزن جي فريڪوئنسي ۾ خاص طور تي واڌ ڪئي وئي. جهنگلي قسم (شڪل 6d) جي مقابلي ۾ ڊيلا گلوبل ميوٽنٽ ۾ IPR ۾ ٽرانسورس سيل ڊويزن جي فريڪوئنسي پڻ وڌيڪ هئي. IPR علائقي کان ٻاهر، جهنگلي قسم ۾ سيل ڊويزن جي زاوين جي وڌيڪ هڪجهڙائي واري ورڇ هئي، جڏهن ته ڊيلا گلوبل ميوٽنٽ IPR (شڪل 6e) وانگر ٽينجينشل ڊويزن کي ترجيح ڏني. اسان ga2 آڪسائيڊيس (ga2ox) ڪوئنٽپل ميوٽنٽ (ga2ox1-1، ga2ox2-1، ga2ox3-1، ga2ox4-1، ۽ ga2ox6-2) جي SAM ۾ سيل ڊويزن جي اورينٽيشن کي به مقدار ڏني، هڪ GA-غير فعال ميوٽنٽ پس منظر جنهن ۾ GA جمع ٿئي ٿو. GA جي سطحن ۾ واڌ سان مطابقت رکندڙ، ڪوئنٽوپل ga2ox ميوٽنٽ انفلورسنس جو SAM Col-0 (ضمني شڪل 12a، b) کان وڏو هو، ۽ Col-0 جي مقابلي ۾، ڪوئنٽوپل ga2ox SAM سيل ڊويزن جي زاوين جي هڪ واضح طور تي مختلف تقسيم ڏيکاري، زاويه جي فريڪوئنسي 50° کان 90° تائين وڌي وئي، يعني ٻيهر ٽينجينشل ڊويزن جي حق ۾ (ضمني شڪل 12a-c). اهڙيءَ طرح، اسان ڏيکاريون ٿا ته GA سگنلنگ ۽ GA جي جمع ٿيڻ جي آئيني چالو ٿيڻ IPR ۽ باقي SAM ۾ پس منظر جي سيل ڊويزن کي متاثر ڪري ٿي.
a، b PI-stained Ler (a) ۽ گلوبل ڊيلا ميوٽنٽ (b) SAM جي L1 پرت جو 3D تصور ڪنفوڪل مائڪروسڪوپي استعمال ڪندي. SAM ۾ ٺهيل نئين سيل والز (پر پرائمورڊيم نه) 10-ڪلاڪ جي عرصي دوران ڏيکاريل آهن ۽ انهن جي زاوي قدرن مطابق رنگين آهن. انسيٽ 0 ڪلاڪ تي SAM ڏيکاري ٿو. رنگ بار هيٺئين ساڄي ڪنڊ ۾ ڏيکاريل آهي. (b) ۾ تير گلوبل ڊيلا ميوٽنٽ ۾ ترتيب ڏنل سيل فائلن جي هڪ مثال ڏانهن اشارو ڪري ٿو. تجربو ساڳئي نتيجن سان ٻه ڀيرا ورجايو ويو. ce Ler ۽ گلوبل ڊيلا جي وچ ۾ پوري SAM (d)، IPR (e)، ۽ غير IPR (f) ۾ سيل ڊويزن جهاز جي واقفيت جي فريڪوئنسي ورڇ جو مقابلو. P قدر ٻن-ٽيل ڪولموگوروف-سميرنوف ٽيسٽ استعمال ڪندي حاصل ڪيا ويا. f، g PI-stained SAM جي ڪولفوڪال تصويرن جو 3D تصور Col-0 (i) ۽ pCUC2::gai-1-VENUS (j) ٽرانسجينڪ ٻوٽن جي. پينل (a، b) 10 ڪلاڪن اندر SAM ۾ ٺهيل نئين سيل والز (پر پرائمورڊيا نه) ڏيکارين ٿا. تجربو ٻه ڀيرا ورجايو ويو ساڳئي نتيجن سان. h–j پوري SAM (h)، IPR (i) ۽ غير IPR (j) ۾ Col-0 ۽ pCUC2::gai-1-VENUS پلانٽس جي وچ ۾ واقع سيل ڊويزن پلین اورينٽيشن جي فريڪوئنسي ورڇ جو مقابلو. P قدر ٻن دم واري ڪولموگوروف-سميرنوف ٽيسٽ استعمال ڪندي حاصل ڪيا ويا.
اسان اڳتي هلي IPR ۾ خاص طور تي GA سگنلنگ کي روڪڻ جي اثر جي جانچ ڪئي. انهي مقصد لاءِ، اسان ڪوٽيلڊون ڪپ 2 (CUC2) پروموٽر استعمال ڪيو ته جيئن VENUS سان ملائي هڪ غالب منفي gai-1 پروٽين جي اظهار کي هلائي سگهجي (pCUC2::gai-1-VENUS لائن ۾). جهنگلي قسم جي SAM ۾، CUC2 پروموٽر SAM ۾ اڪثر IPRs جي اظهار کي هلائي ٿو، جنهن ۾ بارڊر سيلز شامل آهن، P4 کان اڳتي، ۽ ساڳيو مخصوص اظهار pCUC2::gai-1-VENUS ٻوٽن ۾ ڏٺو ويو (هيٺ ڏسو). SAM يا pCUC2::gai-1-VENUS ٻوٽن جي IPR ۾ سيل ڊويزن جي زاوين جي ورڇ جهنگلي قسم جي ٻوٽن کان خاص طور تي مختلف نه هئي، جيتوڻيڪ غير متوقع طور تي اسان ڏٺو ته انهن ٻوٽن ۾ IPR کان سواءِ سيلز 80-90° جي وڌيڪ تعدد تي ورهايل هئا (شڪل 6f-j).
اهو تجويز ڪيو ويو آهي ته سيل ڊويزن جي هدايت SAM جي جاميٽري تي منحصر آهي، خاص طور تي ٽشو وکر 46 پاران پيدا ٿيندڙ ٽينسل اسٽريس. تنهن ڪري اسان پڇيو ته ڇا SAM جي شڪل ڊيلا گلوبل ميوٽنٽ ۽ pCUC2::gai-1-VENUS ٻوٽن ۾ تبديل ڪئي وئي هئي. جيئن اڳ ۾ رپورٽ ڪيو ويو آهي 12، ڊيلا گلوبل ميوٽنٽ SAM جي سائيز جهنگلي قسم جي سائيز کان وڏي هئي (ضمني شڪل 13a، b، d). CLV3 ۽ STM RNA جي ان سيٽو هائبرڊائيزيشن ڊيلا ميوٽنٽ ۾ ميرسٽم جي واڌ جي تصديق ڪئي ۽ اسٽيم سيل نيچ جي پس منظر جي واڌ کي وڌيڪ ڏيکاريو (ضمني شڪل 13e، f، h، i). بهرحال، SAM وکر ٻنهي جينوٽائپس ۾ هڪجهڙائي هئي (ضمني شڪل 13k، m، n، p). اسان جهنگلي قسم جي مقابلي ۾ وکر ۾ تبديلي کان سواءِ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 ڊيلا ڪواڊرپل ميوٽنٽ ۾ سائيز ۾ هڪجهڙائي واڌ ڏٺي (ضمني شڪل 13c، d، g، j، l، o، p). ڊيلا ڪواڊرپل ميوٽنٽ ۾ سيل ڊويزن جي واقفيت جي تعدد پڻ متاثر ٿي، پر ڊيلا مونولٿڪ ميوٽنٽ جي ڀيٽ ۾ گهٽ حد تائين (ضمني شڪل 12d-f). هي خوراک جو اثر، وکر تي اثر جي کوٽ سان گڏ، اهو ظاهر ڪري ٿو ته ڊيلا ڪواڊرپل ميوٽنٽ ۾ باقي RGL3 سرگرمي ڊيلا سرگرمي جي نقصان جي ڪري سيل ڊويزن جي واقفيت ۾ تبديلين کي محدود ڪري ٿي ۽ اهو ته پس منظر سيل ڊويزن ۾ تبديليون SAM جاميٽري ۾ تبديلين جي بدران GA سگنلنگ سرگرمي ۾ تبديلين جي جواب ۾ ٿينديون آهن. جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي، CUC2 پروموٽر SAM ۾ IPR اظهار کي هلائي ٿو جيڪو P4 کان شروع ٿئي ٿو (ضمني شڪل 14a، b)، ۽ ان جي ابتڙ، pCUC2::gai-1-VENUS SAM جو سائيز گهٽ هو پر وکر وڌيڪ هو (ضمني شڪل 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM مورفولوجي ۾ هي تبديلي جهنگلي قسم جي مقابلي ۾ ميڪيڪل دٻاءُ جي مختلف ورڇ جو نتيجو ٿي سگهي ٿي، جنهن ۾ SAM مرڪز کان گهٽ فاصلي تي اعليٰ گردشي دٻاءُ شروع ٿئي ٿو 47. متبادل طور تي، pCUC2::gai-1-VENUS SAM مورفولوجي ۾ تبديليون علائقائي ميڪيڪل ملڪيتن ۾ تبديلين جي نتيجي ۾ ٿي سگهن ٿيون جيڪي ٽرانسجين اظهار 48 جي ڪري پيدا ٿين ٿيون. ٻنهي صورتن ۾، اهو جزوي طور تي GA سگنلنگ ۾ تبديلين جي اثرات کي ختم ڪري سگهي ٿو ان امڪان کي وڌائيندي ته سيلز گردشي/ٽرانسورس اورينٽيشن ۾ ورهائجي ويندا، اسان جي مشاهدن جي وضاحت ڪندي.
گڏ ڪري، اسان جو ڊيٽا تصديق ڪري ٿو ته اعليٰ GA سگنلنگ IPR ۾ سيل ڊويزن جهاز جي پس منظر جي رخ ۾ هڪ سرگرم ڪردار ادا ڪري ٿو. اهي اهو پڻ ڏيکارين ٿا ته ميرسٽم وکر IPR ۾ سيل ڊويزن جهاز جي رخ کي پڻ متاثر ڪري ٿو.
IPR ۾ ڊويزن جهاز جي ٽرانسورس اورينٽيشن، اعلي GA سگنلنگ سرگرمي جي ڪري، اهو مشورو ڏئي ٿو ته GA SAM اندر ايپيڊرمس ۾ هڪ ريڊيل سيل فائل کي اڳ ۾ منظم ڪري ٿو ته جيئن سيلولر تنظيم کي بيان ڪري سگهجي جيڪا بعد ۾ ايپيڊرمل انٽرنڊ ۾ ملندي. حقيقت ۾، اهڙيون سيل فائلون ڊيلا گلوبل ميوٽنٽ جي SAM تصويرن ۾ اڪثر نظر اينديون هيون (شڪل 6b). اهڙي طرح، SAM ۾ GA سگنلنگ جي اسپيشل پيٽرن جي ترقياتي ڪم کي وڌيڪ ڳولڻ لاءِ، اسان وائلڊ-قسم (Ler ۽ Col-0)، ڊيلا گلوبل ميوٽنٽ، ۽ pCUC2::gai-1-VENUS ٽرانسجينڪ ٻوٽن ۾ IPR ۾ سيلز جي اسپيشل تنظيم جو تجزيو ڪرڻ لاءِ ٽائيم ليپس اميجنگ استعمال ڪيو.
اسان ڏٺو ته qmRGA ڏيکاريو ته IPR ۾ GA سگنلنگ سرگرمي P1/P2 کان وڌي ۽ P4 تي پهتي، ۽ هي نمونو وقت سان گڏ مستقل رهيو (شڪل 4a-f ۽ ضمني شڪل 8c-f، k). وڌندڙ GA سگنل سان IPR ۾ سيلز جي مقامي تنظيم جو تجزيو ڪرڻ لاءِ، اسان پهرين مشاهدي کان 34 ڪلاڪن بعد، يعني ٻن کان وڌيڪ پلاسٽيڊ وقتن جو تجزيو ڪندي، Ler IPR سيلز کي مٿي ۽ P4 جي پاسن تي ليبل ڪيو، اسان کي P1/P2 کان P4 تائين پرائمورڊيم ترقي دوران IPR سيلز جي پيروي ڪرڻ جي اجازت ڏني. اسان ٽي مختلف رنگ استعمال ڪيا: پيلو انهن سيلز لاءِ جيڪي P4 جي ويجهو پرائمورڊيم ۾ ضم ڪيا ويا هئا، سائو انهن لاءِ جيڪي IPR ۾ هئا، ۽ جامني انهن لاءِ جيڪي ٻنهي عملن ۾ حصو ورتو (شڪل 7a-c). t0 (0 h) تي، IPR سيلز جون 1-2 پرتون P4 جي سامهون نظر اچي رهيون هيون (شڪل 7a). جيئن توقع ڪئي وئي هئي، جڏهن اهي سيل ورهايا ويا، انهن اهو بنيادي طور تي ٽرانسورس ڊويزن جهاز ذريعي ڪيو (شڪلون 7a-c). ساڳيا نتيجا Col-0 SAM استعمال ڪندي حاصل ڪيا ويا (P3 تي ڌيان ڏيڻ، جن جي بارڊر Ler ۾ P4 سان ملندڙ جلندڙ فولڊ)، جيتوڻيڪ هن جينوٽائپ ۾ گلن جي بارڊر تي ٺهيل فولڊ IPR سيلز کي وڌيڪ تيزيءَ سان لڪائي ڇڏيو (شڪل 7g-i). اهڙيءَ طرح، IPR سيلز جو ڊويزن پيٽرن سيلز کي ريڊيل قطارن ۾ اڳ ۾ منظم ڪري ٿو، جيئن انٽرنوڊس ۾. ريڊيل قطارن جي تنظيم ۽ لڳاتار عضون جي وچ ۾ IPR سيلز جي مقامي ڪرڻ مان ظاهر ٿئي ٿو ته اهي سيلز انٽرنوڊل پروجينٽر آهن.
هتي، اسان هڪ ريٽيوميٽرڪ GA سگنلنگ بايوسينسر، qmRGA تيار ڪيو، جيڪو GA سگنلنگ سرگرمي جي مقداري نقشي جي اجازت ڏئي ٿو جيڪا گڏيل GA ۽ GA ريڪٽر ڪنسنٽريشن جي نتيجي ۾ ٿئي ٿي جڏهن ته اينڊوجينس سگنلنگ رستن سان مداخلت کي گهٽائي ٿي، انهي ڪري سيلولر سطح تي GA فنڪشن تي معلومات فراهم ڪري ٿي. هن مقصد لاءِ، اسان هڪ تبديل ٿيل DELLA پروٽين، mRGA ٺاهيو، جيڪو DELLA رابطي جي ڀائيوارن کي پابند ڪرڻ جي صلاحيت وڃائي چڪو آهي پر GA-induced proteolysis لاءِ حساس رهي ٿو. qmRGA GA جي سطحن ۾ خارجي ۽ اندروني تبديلين ٻنهي جو جواب ڏئي ٿو، ۽ ان جي متحرڪ سينسنگ خاصيتون ترقي دوران GA سگنلنگ سرگرمي ۾ اسپيٽيوٽيمپورل تبديلين جي تشخيص کي فعال ڪن ٿيون. qmRGA پڻ هڪ تمام لچڪدار اوزار آهي ڇاڪاڻ ته ان کي ان جي اظهار لاءِ استعمال ٿيندڙ پروموٽر کي تبديل ڪندي مختلف ٽشوز سان ترتيب ڏئي سگهجي ٿو (جيڪڏهن ضروري هجي)، ۽ GA سگنلنگ رستي جي محفوظ نوعيت ۽ اينجيوسپرمز ۾ PFYRE موٽف کي ڏنو وڃي، اهو ٻين نسلن ڏانهن منتقل ٿيڻ جو امڪان آهي 22. انهي سان مطابقت رکندڙ، چانورن جي SLR1 DELLA پروٽين (HYY497AAA) ۾ هڪ برابر ميوٽيشن پڻ SLR1 جي واڌ کي دٻائڻ واري سرگرمي کي دٻائڻ لاءِ ڏيکاريو ويو جڏهن ته صرف ان جي GA-ثالثي خرابي کي ٿورو گهٽايو، mRGA23 وانگر. قابل ذڪر طور تي، Arabidopsis ۾ تازين مطالعي مان ظاهر ٿيو ته PFYRE ڊومين (S474L) ۾ هڪ واحد امينو ايسڊ ميوٽيشن RGA جي ٽرانسڪرپشنل سرگرمي کي تبديل ڪيو بغير ٽرانسڪرپشن فيڪٽر پارٽنرز سان رابطو ڪرڻ جي صلاحيت کي متاثر ڪرڻ جي 50. جيتوڻيڪ هي ميوٽيشن mRGA ۾ موجود 3 امينو ايسڊ متبادل جي تمام ويجهو آهي، اسان جي مطالعي مان ظاهر ٿئي ٿو ته اهي ٻئي ميوٽيشنز DELLA جي مختلف خاصيتن کي تبديل ڪن ٿا. جيتوڻيڪ گھڻا ٽرانسڪرپشن فيڪٽر پارٽنر DELLA26,51 جي LHR1 ۽ SAW ڊومينز سان ڳنڍيل آهن، PFYRE ڊومين ۾ ڪجهه محفوظ امينو ايسڊ انهن رابطي کي مستحڪم ڪرڻ ۾ مدد ڪري سگهن ٿا.
انٽرنوڊ ڊولپمينٽ ٻوٽن جي فن تعمير ۽ پيداوار جي بهتري ۾ هڪ اهم خاصيت آهي. qmRGA IPR انٽرنوڊ پروجينٽر سيلز ۾ اعليٰ GA سگنلنگ سرگرمي ظاهر ڪئي. مقداري تصوير ۽ جينياتيات کي گڏ ڪندي، اسان ڏيکاريو ته GA سگنلنگ نمونا SAM ايپيڊرمس ۾ سرڪلر/ٽرانسورس سيل ڊويزن جهازن کي سپر امپوز ڪن ٿا، انٽرنوڊ ڊولپمينٽ لاءِ گهربل سيل ڊويزن تنظيم کي شڪل ڏين ٿا. ترقي دوران سيل ڊويزن جهاز جي واقفيت جا ڪيترائي ريگيوليٽر سڃاڻپ ڪيا ويا آهن 52,53. اسان جو ڪم هڪ واضح مثال فراهم ڪري ٿو ته ڪيئن GA سگنلنگ سرگرمي هن سيلولر پيرا ميٽر کي منظم ڪري ٿي. DELLA پري فولڊنگ پروٽين ڪمپليڪس 41 سان رابطو ڪري سگهي ٿو، تنهن ڪري GA سگنلنگ سڌو سنئون ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبول اورينٽيشن 40,41,54,55 کي متاثر ڪندي سيل ڊويزن جهاز جي واقفيت کي منظم ڪري سگهي ٿو. اسان غير متوقع طور تي ڏيکاريو ته SAM ۾، اعليٰ GA سگنلنگ سرگرمي جو تعلق سيل جي ڊيگهه يا ڊويزن نه هو، پر صرف واڌ اينيسوٽروپي، جيڪو IPR ۾ سيل ڊويزن جي هدايت تي GA جي سڌي اثر سان مطابقت رکي ٿو. جڏهن ته، اسان اهو خارج نٿا ڪري سگهون ته هي اثر اڻ سڌي طرح به ٿي سگهي ٿو، مثال طور GA-حوصلہ افزائي سيل وال نرم ڪرڻ 56 ذريعي. سيل وال جي خاصيتن ۾ تبديليون ميڪيڪل دٻاءُ 57,58 پيدا ڪن ٿيون، جيڪو ڪارٽيڪل مائڪروٽيوبولس جي رخ کي متاثر ڪندي سيل ڊويزن جهاز جي رخ کي به متاثر ڪري سگهي ٿو 39,46,59. GA-حوصلہ افزائي ميڪيڪل دٻاءُ ۽ GA پاران مائڪروٽيوبولس رخ جي سڌي ضابطي جا گڏيل اثر انٽرنوڊس کي بيان ڪرڻ لاءِ IPR ۾ سيل ڊويزن رخ جي هڪ مخصوص نموني پيدا ڪرڻ ۾ شامل ٿي سگهن ٿا، ۽ هن خيال کي جانچڻ لاءِ وڌيڪ مطالعي جي ضرورت آهي. ساڳئي طرح، پوئين مطالعي انٽرنوڊس جي ٺهڻ جي ڪنٽرول ۾ DELLA-انٽريڪٽنگ پروٽين TCP14 ۽ 15 جي اهميت کي اجاگر ڪيو آهي 60,61 ۽ اهي عنصر GA جي عمل کي BREVIPEDICELLUS (BP) ۽ PENNYWISE (PNY) سان گڏ وچولي ڪري سگهن ٿا، جيڪي انٽرنوڊس جي ترقي کي منظم ڪن ٿا ۽ GA سگنلنگ 2,62 تي اثر انداز ٿيڻ لاءِ ڏيکاريا ويا آهن. ڏنو ويو آهي ته ڊي ايل اي براسينوسٽرائيڊ، ايٿيلين، جيسمونڪ ايسڊ، ۽ ابسسيڪ ايسڊ (ABA) سگنلنگ رستن سان لهه وچڙ ڪن ٿا 63،64 ۽ اهي هارمون مائڪروٽيوبول اورينٽيشن 65 تي اثر انداز ٿي سگهن ٿا، سيل ڊويزن اورينٽيشن تي GA جا اثر ٻين هارمونز جي وچ ۾ پڻ ٿي سگهن ٿا.
ابتدائي سائٽولوجيڪل مطالعي مان ظاهر ٿيو ته Arabidopsis SAM جا اندروني ۽ ٻاهرين علائقا انٽرنوڊ ڊولپمينٽ لاءِ گهربل آهن 2,42. حقيقت اها آهي ته GA اندروني ٽشوز ۾ سيل ڊويزن کي فعال طور تي منظم ڪري ٿو 12 SAM ۾ ميرسٽم ۽ انٽرنوڊ سائيز کي منظم ڪرڻ ۾ GA جي ٻٽي ڪم جي حمايت ڪري ٿو. هدايتي سيل ڊويزن جو نمونو اندروني SAM ٽشو ۾ پڻ سختي سان منظم ڪيو ويو آهي، ۽ هي ضابطو اسٽيم جي واڌ لاءِ ضروري آهي 52. اهو جانچڻ دلچسپ هوندو ته ڇا GA اندروني SAM تنظيم ۾ سيل ڊويزن جهاز کي ترتيب ڏيڻ ۾ پڻ ڪردار ادا ڪري ٿو، انهي ڪري SAM اندر انٽرنوڊ جي وضاحت ۽ ترقي کي هم وقت سازي ڪري ٿو.
ٻوٽا مٽيءَ ۾ ان ويٽرو ۾ پوکيا ويا يا 1x مراشيگ-اسڪوگ (ايم ايس) ميڊيم (ڊچيفا) کي معياري حالتن (16 ڪلاڪ روشني، 22 °C) ۾ 1٪ سوڪروز ۽ 1٪ آگر (سگما) سان گڏ ڪيو ويو، سواءِ هائپوڪوٽائل ۽ روٽ جي واڌ جي تجربن جي جن ۾ ٻج مسلسل روشني ۽ 22 °C هيٺ عمودي پليٽن تي پوکيا ويا. نائٽريٽ تجربن لاءِ، ٻوٽا تبديل ٿيل ايم ايس ميڊيم (بايو ورلڊ پلانٽ ميڊيم) تي پوکيا ويا جيڪي مناسب نائٽريٽ (0 يا 10 ايم ايم KNO3)، 0.5 ايم ايم NH4-سڪسينيٽ، 1٪ سوڪروز ۽ 1٪ اي-اگار (سگما) سان گڏ ڊگهي ڏينهن جي حالتن ۾.
pDONR221 ۾ داخل ڪيل GID1a cDNA کي pDONR P4-P1R-pUBQ10 ۽ pDONR P2R-P3-mCherry سان pB7m34GW ۾ ٻيهر ملايو ويو ته جيئن pUBQ10::GID1a-mCherry پيدا ٿئي. pDONR221 ۾ داخل ڪيل IDD2 DNA کي p35S:IDD2-RFP پيدا ٿيڻ لاءِ pB7RWG266 ۾ ٻيهر ملايو ويو. pGID1b::2xmTQ2-GID1b پيدا ڪرڻ لاءِ، GID1b ڪوڊنگ علائقي جي اپ اسٽريم ۾ 3.9 kb ٽڪرو ۽ GID1b cDNA (1.3 kb) ۽ ٽرمينيٽر (3.4 kb) تي مشتمل 4.7 kb ٽڪرو پهريون ڀيرو ضمني جدول 3 ۾ پرائمر استعمال ڪندي وڌايو ويو ۽ پوءِ ترتيب وار pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ۽ pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ۾ داخل ڪيو ويو، ۽ آخرڪار گيٽ وي ڪلوننگ استعمال ڪندي pDONR221 2xmTQ268 سان pGreen 012567 ٽارگيٽ ویکٹر ۾ ٻيهر ملايو ويو. pCUC2::LSSmOrange پيدا ڪرڻ لاءِ، CUC2 پروموٽر سيڪوئنس (ATG جو 3229 bp اپ اسٽريم) جنهن کان پوءِ N7 نيوڪليئر لوڪلائيزيشن سگنل ۽ NOS ٽرانسڪرپشنل ٽرمينيٽر سان وڏي اسٽوڪس-شفٽ ٿيل mOrange (LSSmOrange)69 جي ڪوڊنگ سيڪوئنس کي گيٽ وي 3-فريگمينٽ ريڪمبينيشن سسٽم (انويٽروجن) استعمال ڪندي pGreen kanamycin ٽارگيٽنگ ویکٹر ۾ گڏ ڪيو ويو. پلانٽ بائنري ويڪٽر کي Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ۾ متعارف ڪرايو ويو ۽ Agrobacterium infiltration method ذريعي Nicotiana benthamiana leaves ۾ ۽ Arabidopsis thaliana Col-0 ۾ floral dip method ذريعي ترتيب وار متعارف ڪرايو ويو. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ۽ pCLV3::mCherry-NLS qmRGA کي ترتيب وار لاڳاپيل ڪراس جي F3 ۽ F1 نسلن کان الڳ ڪيو ويو.
آر اين اي ان سيٽو هائبرڊائيزيشن تقريبن 1 سينٽي ميٽر ڊگھي شوٽ ٽِپس72 تي ڪئي وئي، جن کي گڏ ڪيو ويو ۽ فوري طور تي FAA محلول (3.7٪ فارملڊيهائيڊ، 5٪ ايسٽڪ ايسڊ، 50٪ ايٿانول) ۾ فڪس ڪيو ويو جيڪو 4 °C تي اڳ ۾ ٿڌو ڪيو ويو. 2 × 15 منٽ ويڪيوم علاج کان پوءِ، فڪسيٽيوٽ کي تبديل ڪيو ويو ۽ نمونن کي رات جو انڪيوبيٽ ڪيو ويو. GID1a، GID1b، GID1c، GAI، RGL1، RGL2، ۽ RGL3 cDNAs ۽ اينٽي سينس پروبس کي انهن جي 3′-UTRs لاءِ ضمني جدول 3 ۾ ڏيکاريل پرائمر استعمال ڪندي سنٿيسائز ڪيو ويو جيئن روزيئر ۽ ٻين پاران بيان ڪيو ويو آهي.73. ڊيگوڪسيجنن-ليبل ٿيل پروبس کي ڊيگوڪسيجنن اينٽي باڊيز (3000-فولڊ ڊائليشن؛ روش، ڪيٽلاگ نمبر: 11 093 274 910) استعمال ڪندي مدافعتي طور تي ڳوليو ويو، ۽ حصن کي 5-برومو-4-ڪلورو-3-انڊولائل فاسفيٽ (BCIP، 250-فولڊ ڊائليشن)/نائٽروبليو ٽيٽرازوليم (NBT، 200-فولڊ ڊائليشن) محلول سان رنگيو ويو.